具硝化功能的枯草芽孢桿菌SC228及其用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌SC228，其保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC228?Bacillus?subtilisSC228，保藏號(hào)為：CCTCC?NO：M?2016304。本發(fā)明專利技術(shù)還同時(shí)提供了上述枯草芽孢桿菌SC228的用途：作為硝化功能菌，去除水體中的氨態(tài)氮。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SC228及其用途。
技術(shù)介紹
我國(guó)是世界水產(chǎn)大國(guó)，同時(shí)也是世界上唯一水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高于捕撈產(chǎn)量的國(guó)家。自上世紀(jì)80年代，在改革開(kāi)放和經(jīng)濟(jì)效益的驅(qū)動(dòng)下，我國(guó)的水產(chǎn)業(yè)取得了舉世矚目的成就，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)，特別是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有越來(lái)越重要的地位。2012年中國(guó)的水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到5907.68萬(wàn)噸，漁業(yè)總產(chǎn)值8706.01億元，占中國(guó)農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的9.73％。2013年我國(guó)水產(chǎn)品出口克服了國(guó)內(nèi)生產(chǎn)成本增加以及人民幣升值、世界經(jīng)濟(jì)尚未完全擺脫低迷局面、貿(mào)易壁壘增多等不利因素影響，實(shí)現(xiàn)了出口的較快增長(zhǎng)，水產(chǎn)品出口額首次突破200億美元，再創(chuàng)歷史新高，連續(xù)12年位居全球首位。集約化生產(chǎn)在提高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也帶來(lái)新的問(wèn)題，如養(yǎng)殖污水排放量劇增等一系列環(huán)境問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年，全國(guó)廢水排放量684.8億噸，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)氨氮排放量2.3萬(wàn)噸，排放化學(xué)需氧量54.8萬(wàn)噸。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，投放的餌料只有少部分被魚(yú)類(lèi)吸收，大部分則直接排放到水體中。由于殘餌和魚(yú)類(lèi)代謝物不能及時(shí)清除而沉積水底，導(dǎo)致水體缺氧、水質(zhì)惡化。養(yǎng)殖污水中富含N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接排入水環(huán)境會(huì)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，污染水體，還會(huì)造成水資源和能源的大量浪費(fèi)。研究表明，飼料中僅有13.9％的氮和25.4％的磷被水產(chǎn)動(dòng)物利用，其他的氮磷富集在水體中或沉積在底泥中。1999-2000年，水產(chǎn)養(yǎng)殖污染事件發(fā)生2067起，導(dǎo)致20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。水質(zhì)的惡化主要表現(xiàn)在pH值、溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽、磷酸鹽、硫化物以及化學(xué)需氧量(COD)等指標(biāo)的變化上。其中氨氮、亞硝酸鹽氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中重要的污染脅迫因子。目前，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化的方法一般采用物理法、化學(xué)法或者生物法，但是這些方法存在很多弊端。比如在養(yǎng)殖的間歇期，人們也常用干塘和清淤的方法去除池塘沉積物中的污染物，但這種方法耗時(shí)耗力，成本較高。近年來(lái)，有益微生物因其生長(zhǎng)繁殖快、比面值大、吸收轉(zhuǎn)化快、適應(yīng)性強(qiáng)以及種類(lèi)多、分布廣等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用。但是，目前所用微生態(tài)制劑存在有益菌株種類(lèi)偏少、有效活菌數(shù)目低、不耐高溫、耐鹽范圍較窄等缺陷，不能完全滿足生產(chǎn)實(shí)踐中的需要，從而制約了微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化上的應(yīng)用。枯草芽孢桿菌能夠改善有害藍(lán)藻泛溢造成的水質(zhì)渾濁問(wèn)題，水質(zhì)由渾變清，具有很強(qiáng)的
凈化水質(zhì)功能，具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解，使水產(chǎn)類(lèi)動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用更加充分。枯草芽孢桿菌可以減少對(duì)蝦病害發(fā)生，可以大大提高對(duì)蝦產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益，生物環(huán)保，刺激水產(chǎn)動(dòng)物免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；減少對(duì)蝦病害發(fā)生，明顯提高對(duì)蝦產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益，凈化水質(zhì)，無(wú)污染，無(wú)殘留。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SC228及其用途。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種枯草芽孢桿菌SC228，其保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC228 Bacillus subtilisSC228，保藏號(hào)為：CCTCC NO：M 2016304。本專利技術(shù)還同時(shí)提供了上述枯草芽孢桿菌SC228的用途：作為硝化功能菌。作為本專利技術(shù)的枯草芽孢桿菌SC228的用途的改進(jìn)：去除水體中的氨態(tài)氮。水體為養(yǎng)殖水體。該菌株在LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其余為水；pH7.0，121℃滅菌20分鐘)平板上菌落直徑為2.5-3.0mm，菌落表面粗糙褶皺、不透明，不閃光，擴(kuò)張，邊緣不整齊，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭，菌株數(shù)量可高達(dá)1×108cfu/g以上。菌株SC228在好氧條件下，在24h內(nèi)可去除50mg/L氨態(tài)氨及100mg/L亞硝酸態(tài)氮。本專利技術(shù)的枯草芽孢桿菌SC228具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1)、培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)速度快；2)、培養(yǎng)發(fā)酵后的活菌菌株數(shù)目高；3)、該菌可有效去除養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮、亞硝酸態(tài)氮，從而顯著改善水質(zhì)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此：實(shí)施例1、枯草芽孢桿菌SC228的獲得1、菌的分離純化取草魚(yú)池水，稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其余為水；pH7.0，121℃滅菌20分鐘)表面連續(xù)劃線培養(yǎng)，選擇那些形態(tài)不一樣的菌落，重復(fù)幾次后便可形成單獨(dú)孤立的菌落，因而獲得純培養(yǎng)菌株。2、菌株的初篩根據(jù)不同含氮化合物的化學(xué)性質(zhì)，用相應(yīng)的顯色劑分別與每株菌利用三種氮源后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(含氮化合物)進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的有無(wú)或深淺，定性地鑒定該菌種是否參與水體氮轉(zhuǎn)化以及在氮循環(huán)中的具體作用。具體如下：1)、亞硝酸鹽氮的定性檢測(cè)：培養(yǎng)液用亞硝酸鹽顯色劑點(diǎn)樣，若出現(xiàn)紅色則說(shuō)明培養(yǎng)液中存在亞硝酸鹽氮，且顏色越深濃度越大。2)、氨氮的定性檢測(cè)：用鈉氏試劑點(diǎn)樣，若出現(xiàn)黃色反應(yīng)，說(shuō)明培養(yǎng)液中存在氨氮，且顏色越深濃度越大。3)、硝酸鹽氮的定性檢測(cè)：(1)對(duì)于含有亞硝酸鹽的培養(yǎng)液檢測(cè)硝酸鹽時(shí)：對(duì)于1mL培養(yǎng)液中殘余的亞硝酸鹽(濃度≤150mg/L)，加入1mol/L的鹽酸50μL，混勻，加入50g/L的氨基磺酸銨溶液50μL，混勻，以消除亞硝酸鹽對(duì)硝酸鹽顯色的影響。將2μL的該培養(yǎng)液滴入10μL的二苯胺溶液中，根據(jù)是否顯示藍(lán)色及藍(lán)色的深淺，初步判斷培養(yǎng)液中硝酸鹽含量的多少。(2)對(duì)于不含有亞硝酸鹽的培養(yǎng)液檢測(cè)硝酸鹽時(shí)：對(duì)于1mL的待檢測(cè)培養(yǎng)液，由于已知培養(yǎng)液中不含有亞硝酸鹽，直接將2μL的該培養(yǎng)液滴入10μL的二苯胺溶液中，根據(jù)是否顯示藍(lán)色及藍(lán)色的深淺，初步判斷培養(yǎng)液中硝酸鹽含量的多少。從中篩選出能夠降氨氮和亞硝酸鹽氮的菌株。測(cè)定方法采用國(guó)家環(huán)保總局推薦方法(國(guó)家環(huán)保局，2002)。3、菌株復(fù)篩經(jīng)初篩的菌株涂布于BTB培養(yǎng)基(檸檬酸鈉5.66g、Na2HPO4 7.9g、NaNO3 0.8415g/NaNO2 0.683g/NH4Cl 0.5296g、KH2PO4 1.5g、Mg2SO4·7H2O 0.01g、微量元素溶液2mL、去離子水1000mL、pH 7.2，121℃滅菌20分鐘)上進(jìn)行復(fù)篩，得到一株硝化效果較好的菌，命名為SC228。4、采用甘油保藏法在滅菌的菌種管中，加入l.0ml細(xì)菌培養(yǎng)液，0.5ml 50％(體積濃度)的甘油，混勻后于-80℃冰箱保存。5、菌種鑒定(1)形態(tài)特征枯草芽孢桿菌SC228在LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其余為水；pH7.0，121℃滅菌，20分鐘)平板上菌落直徑為2.5-3.0mm，菌落表面粗糙褶皺、不透明，不閃光，擴(kuò)張，邊緣不整齊，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。(2)16S rDNA序列分析對(duì)分離篩選到菌株SC228進(jìn)行進(jìn)一步的16S rDNA序列分析與比對(duì)。引物序列如下：上游引物(P1)：5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’下游引物(P6)：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
枯草芽孢桿菌SC228，其特征是，保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC228Bacillus?subtilisSC228，保藏號(hào)為：CCTCC?NO：M?2016304。

【技術(shù)特征摘要】
1.枯草芽孢桿菌SC228，其特征是，保藏名稱為：枯草芽孢桿菌SC228Bacillus subtilisSC228，保藏號(hào)為：CCTCC NO：M 2016304。2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SC2...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李衛(wèi)芬，沈文英，張小平，王佰魁，王一冰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，紹興文理學(xué)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江;33