本發明專利技術公開了一株粘質沙雷氏菌RZ?21?C6及其應用，本發明專利技術所述粘質沙雷氏菌RZ21?C6，保藏編號為CGMCCNo.12714。本發明專利技術突變菌株具有底物利用效率高、遺傳穩定性高、靈菌紅素產量高的優點，其對木糖的利用效果尤佳。在5L發酵罐中，以木糖為主要成分的農殘秸稈水解液廉價生物質碳源被開發用于靈菌紅素生產，多批次發酵時靈菌紅素產量可達15?20g/L，總還原糖直接被用于靈菌紅素合成的轉化率在20％以上。本發明專利技術提供的粘質沙雷氏菌常壓室溫等離子體誘變菌株生產靈菌紅素的方法，以及該菌對木糖和農殘秸稈水解液的利用可以推進靈菌紅素產業化的實現，可以用于生物醫藥、生態環境治理和農業生防等領域。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，具體涉及一株常壓室溫等離子體誘變后的粘質沙雷氏菌高效利用木糖或農殘秸稈水解液高產靈菌紅素的方法。
技術介紹
靈菌紅素是一個天然紅色素家族的總稱，其基本結構是由三個吡咯環組成的甲氧基吡咯骨架，分子式為C20H25N3O，分子量為323.2Da。自1929年Amako等在研究沙雷氏菌生長時發現并由Harashima等在1960年首次分離獲得以來，對該物質性質及生物活性的研究一直備受關注。除了作為一種天然的生物染料之外，它的許多生物學活性也被逐漸人們所認識，包括抗細菌、抗瘧疾、抗真菌和抗原生動物的活性。大量報道還表明其在水體富營養化的水污染治理和農業生防上也有應用價值。隨著近幾年對細胞凋亡的研究發現，靈菌紅素能引起癌細胞的凋亡而對正常細胞的毒性卻很小，是一種良好的抗癌藥物。美國國立癌癥研究所更是發現合適濃度的靈菌紅素對人的57種不同腫瘤細胞具有明顯抗性作用。靈菌紅素作為一種次級代謝物，其生產主要是通過微生物合成的。自然界中產靈菌紅素的菌株主要包括粘質沙雷氏菌、放線菌、假單胞菌，以及近年來發現的某些特殊的海洋細菌等。其中以對粘質沙雷氏菌的研究最為廣泛。靈菌紅素產物在粘質沙雷氏菌的生物合成中是通過兩個雙歧途徑完成的，前體物是一個單吡咯前體2-甲基-3-戊基吡咯和一個雙吡咯前體4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧基乙醛，經過縮合酶縮合偶聯形成線性的三吡咯化合物靈菌紅素。靈菌紅素的合成是由pig基因簇完成的，該基因簇包括16個基因，其中14個基因直接負責靈菌紅素及其前體的合成，另外兩個基因負責調控這一生物合成過程。這表明靈菌紅素的合成是一個多基因控制，受到多因素影響的復雜生物過程。目前微生物發酵法生產靈菌紅素的產量千差萬別，文獻報道中產量大多不高于1g/L，只有少數突破10g/L的產量。這主要是由于粘質沙雷氏菌合成靈菌紅素的條件影響極為復雜。造成靈菌紅素產量差異很大的原因主要來自菌株差異、碳氮源等培養基底物成分、溫度、pH值、通氣量等。而其中不同的底物和生產菌株本身的差異對色素成分及產量影響最大。尤其是依賴于菌株自身的特性的粘質沙雷氏菌對低值碳源的利用和靈菌紅素的高效合成方面仍有極大的提升空間。值得一提的是目前尚沒有對木糖做底物合成靈菌紅素的相關報道，而木糖主要是作為大自然界最豐富的木質纖維素生物質主要成分木聚糖的單體，開發能夠高效利用以木糖為主要成分的木質纖維素生物質水解液的遺傳穩定的工業生產菌株已經成為可再生化學品
和能源生物煉制領域的研究熱點。微生物的誘變育種因具有研究條件和技術要求不高、簡便快捷、效果顯著的特點，成為實驗室和企業最常用的方法之一。對粘質沙雷氏菌進行誘變育種以提高靈菌紅素的產量也有報道，如氯化鋰和甲磺酸乙酯處理，紫外誘變和微波誘變等，但效果有限。而常壓室溫等離子體由于自身溫度低、活性粒子濃度高、種類多樣且作用于微生物能夠改變其通透性同時引起基因損傷，從而有望導致微生物基因序列及其代謝網絡的變化，引發微生物在較大幾率上發生有益于生產的正突變。本專利技術利用本實驗室篩選的一株產靈菌紅素粘質沙雷氏菌為出發菌株，前期通過發酵優化后靈菌紅素產量為2.64g/L，仍然存在產量偏低、菌株易退化，遺傳穩定性較差等缺陷。本專利技術擬通過常壓室溫等離子體進行誘變育種，期望解決上述菌株遺傳穩定性較差，靈菌紅素產量不高，對廉價生物質碳源利用不足的問題，尤其是缺乏對含有木糖的大量農殘物秸稈水解液的利用能力。
技術實現思路
本專利技術的目的在于根據現有技術中存在的上述不足，提供一種粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714，以及使用該菌株高效生產靈菌紅素的方法。本專利技術上述目的通過以下技術方案予以實現：一株高產靈菌紅素的突變菌株，名稱為粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)RZ 21-C6，保藏編號為CGMCCNo.12714。所述菌株的獲得包括如下步驟：(1)將經過搖床培養的粘質沙雷氏菌原始菌株的發酵液用生理鹽水稀釋到106-107個/mL，取10μL涂布在ARTP誘變儀器金屬載體上，參數設置為：氣流量10-15L/min，電源功率80-120W，處理時間為15-240s。誘變結束后，用無菌鑷子將金屬片放到裝有1mL生理鹽水的離心管中。在振蕩器上震蕩1-2min，把附著在金屬載片上的微生物洗脫下來形成菌懸液。(2)將所得到的菌懸液進行合適的梯度稀釋，取0.1mL稀釋液涂布到含有發酵液培養基的平板上，28-32℃培養箱培養24-48h，做致死率曲線。(3)選取致死率在95％以上處理時間的紅色優于原始菌株的單菌落接種到含有木糖的96孔平板上避光培養，24-48h后檢測其生物量和色素量，篩選出色素產量和生物量顯著高于其他的菌株。(4)所獲得最佳菌株連續發酵培養10代以上以鑒定其穩定性，獲得的穩定高產突變菌株為粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714。本專利技術突變菌株利用木糖或者農殘秸稈水解液發酵生產靈菌紅素的方法包括如下步驟：(1)接種2-3環粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714至30mL的一級種子培養基中，該培養基配
方為酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH為7.0，28-32℃、搖瓶轉速150-300rpm培養12-24h至OD600＝1.0。(2)取上述一級種子液，按3％-5％的接種量接種至30mL二級種子培養基，該培養基配方為木糖20g/L以內，蛋白胨25g/L，FeSO4·7H2O 0.23mM和CaCl2 16.68mM，利用CaCO3控制pH在6.0-8.5，3％-5％接種量，在28-32℃條件150-300rpm避光搖瓶培養24-48h；(3)接種3％-5％的二級種子培養液在5L發酵罐里發酵產靈菌紅素，裝液量3L，初始碳源為木糖或者農殘秸稈水解液總還原糖濃度20g/L以內，蛋白胨25g/L，FeSO4·7H2O 0.23mM和CaCl2 16.68mM，培養基中農殘秸稈水解液總還原糖初始濃度消耗至5g/L以下時，單次直接補充濃縮農殘秸稈水解液至總還原糖濃度為原初始濃度，補料次數不限，發酵溫度為28-32℃，利用HCl和NaOH控制pH在6.0-8.5，溶氧40-60％，轉速為300-400rpm，避光發酵150-200h。與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：(1)通過ARTP誘變育種，獲得一株性狀優良，遺傳穩定性高，高產靈菌紅素的粘質沙雷氏突變菌株。(2)本專利技術獲得的粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714不僅能夠高效利用傳統的蔗糖等碳源，而且還能利用木糖及其與其他單糖的混合組分發酵生產靈菌紅素。(3)以玉米秸稈水解液為代表的廉價農殘秸稈生物質首次被開發用于靈菌紅素的生產，經發酵補料策略優化，靈菌紅素濃度可達15-20g/L。附圖說明圖1為粘質沙雷氏菌ARTP誘變的致死率曲線。圖2為19株正突變菌株菌體生長與色素合成的比較。圖3為靈菌紅素的紫外可見吸收光譜。圖4為靈菌紅素的高分辨率質譜圖(FT-ICR-MS)。圖5為突變菌的菌體生長和色素合成的遺傳穩定性分析。圖6為原始菌株與突變菌株的TEM顯微觀察。圖7為原始菌株和突變菌株的細胞膜滲透性分析(A圖為外膜，B圖為內膜)。圖8為模擬混糖發酵生產靈菌紅素的過程曲本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種粘質沙雷氏菌(Serratia?marcescens)RZ?21?C6，保藏編號為CGMCCNo.12714。
【技術特征摘要】
1.一種粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)RZ 21-C6，保藏編號為CGMCCNo.12714。2.權利要求1所述粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714在生產靈菌紅素中的應用。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，是以木糖或者農殘秸稈水解液為碳源。4.一種利用權利要求1所述粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714生產靈菌紅素的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)粘質沙雷氏菌CGMCCNo.12714的一級種子培養基為酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，裝液量30mL，在28-32℃條件150-300rpm搖瓶培養12-24h至OD600＝1.0；(2)二級種子培養基為木糖20g/L以內，蛋白胨25g/L，FeSO4·...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳飛，戴傳超，楊晶，楊啟銀，
申請(專利權)人：南京師范大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。