蛋白質制造技術

本發明專利技術涉及一種修飾的GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相較于親本GH10木聚糖酶，所述修飾的GH10木聚糖酶或其片段具有提高的熱穩定性，所述親本GH10木聚糖酶已在以下位置中的至少兩處被修飾：7、33、79、217和298，其中編號基于FveXyn4(SEQ?ID?No.1)的氨基酸編號。具體地講，根據本發明專利技術的所述修飾的木聚糖酶具有以下修飾：N7D；T33V；K79Y、K79V、K79F、K79I、K79L或K79M(優選地K79Y、K79F或K79V，更優選地K79Y)；A217Q、A217E、A217P、A217D或A217M(優選地A217Q、A217E或A217P，更優選地A217Q)；和T298Y、T298F或T298W(優選地T298Y或T298F，更優選地T298Y)。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及新型的熱穩定木聚糖酶；所述木聚糖酶在下列應用中的用途：包括用于飼料原料、釀造或制麥芽、含阿拉伯糖木聚糖的原材料(如基于谷物的材料)的處理中，例如用于生物燃料或其它發酵產品(包括生化物質，例如生物基異戊二烯)的制備中和/或用于小麥面筋-淀粉分離行業中；使用這些木聚糖酶的方法；以及包含所述木聚糖的組合物(諸如飼料添加劑組合物)。專利技術背景多年來，內切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)(本文中稱為木聚糖酶)一直用于修飾源自植物細胞壁材料的復合碳水化合物。本領域眾所周知的是，不同的木聚糖酶(源自不同微生物或植物)的功能差異非常大。木聚糖酶是給予可將直鏈多糖β-1,4-木聚糖降解成低聚木糖或木糖，因而使半纖維素(植物細胞壁的主要組分之一)分解的酶類型的名稱。基于結構和遺傳信息，木聚糖酶被分類為不同糖苷水解酶(GH)家族(Henrissat,(1991)Biochem.J.280,309-316)。最初所有已知且表征的木聚糖酶屬于家族GH10或GH11。然后進一步的工作鑒別了屬于家族GH5、GH7、GH8和GH43的多種其它類型的木聚糖酶(Collins等人，(2005)FEMS Microbiol Rev.,29(1),3-23)。迄今為止，GH11家族與所有其它GH家族都不同，它是唯一一個僅由木聚糖特異性木聚糖酶組成的家族。GH11木聚糖酶的結構可被描述為β-果凍卷(β-Jelly roll)結構或全β鏈夾心折疊結構(Himmel等人，1997Appl.Biochem.Biotechnol.63-65,315-325)。GH11酶具有約20kDa的催化結構域。GH10木聚糖酶具有分子量范圍為32-39kDa的催化結構域。GH10木聚糖酶的催化結構域的結構由八重β/α桶狀結構組成(Harris等人，1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。已獲知大量GH10家族酶的三維結構，首先被解析的是以下酶的三維結構：變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶A(Derewenda等人，JBiol Chem 1994Aug 19；269(33)20811-4)、糞肥纖維單胞菌(C.fimi)內切聚糖酶Cex(White等人，Biochemistry 1994Oct 25；33(42)12546-52)以及日本纖維弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(此前為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)亞種木聚糖酶A)(Harris等人，Structure 1994Nov 15；2(11)1107-16.)。作為宗族GHA的成員，它們具有經典的(α/β)8TIM桶狀折疊，其中兩個關鍵活性位點谷氨酸位于β鏈4(酸/堿)和7(親核體)的C末端(Henrissat等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1995Jul 18；92(15)7090-4)。已在充分表征且純的底物上開展對木聚糖酶功能進行表征的全面研究(Kormelink等人，1992，“Characterisation and mode of action of xylanases and some accessory enzymes”，博士論文，Agricultural University Wageningen,Holland(第175頁，英語和荷蘭語摘要))。這些研究表明，對于阿拉伯木聚糖(AX)的木糖主鏈的置換而言，不同木聚糖酶具有不同特異性要求。一些木聚糖酶需要三種未置換的木糖殘基來水解木糖主鏈；其它需要僅一種或兩種。這些特異性差異的原因被認為歸因于催化結構域內的三維結構，這繼而取決于木聚糖酶的一級結構，即氨基酸序列。然而，迄今為止尚未記載當木聚糖酶在復雜環境(諸如植物材料，例如飼料原料)中發揮作用時，氨基酸序列中的這些差異會轉換為木聚糖酶功能的差異。植物材料中(例如小麥中)的木聚糖酶底物傳統上被劃分為兩種級分：水不可提取的AX(WU-AX)和水可提取的AX(WE-AX)。對于為什么有兩種不同AX級分，已有許多解釋。早期文獻D’Appolonia和MacArthur(1976,Cereal Chem.53.711-718)以及Montgomery和Smith(1955,J.Am.Chem.Soc.77.3325-332)描述了WE-AX與WU-AX之間的置換度有著極大差異。WE-AX中存在最高置換度。這用于解釋為什么一些AX是可提取的。高置換度使聚合物變得可溶，相比之下，較低置換度將在聚合物之間形成氫鍵，從而導致沉淀。不同的木聚糖酶的功能差異被認為歸因于木聚糖酶特異性的差異，因此它們偏好WU-AX底物或WE-AX底物。已經報道了來自近100種不同生物體(包括植物、真菌和細菌)的木聚糖酶。木聚糖酶被分類為超過40種糖基水解酶家族中的若干種。糖基水解酶(包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶和其它糖酶)基于諸如氨基酸序列、其三維結構以及其催化位點幾何形狀等特性來分類(Gilkes等人，1991,Microbiol.Reviews 55:303-315)。附圖簡述圖1A示出了本專利技術木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.26)。加下劃線的(小寫體)序列部分表示N端信號肽可在酶成熟之被切割。以粗斜體示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通過翻譯后修飾被切割。在一些實施方案中，該序列可為主鏈序列。圖1B示出了本專利技術木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.27)。以粗斜體示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通過翻譯后修飾被切割。在一些實施方案中，該序列可為主鏈序列。圖1C示出了本文稱為FveXyn4的木聚糖酶的多肽序列(SEQ ID No.1)。這是酶的活性形式。在本文中其可被稱為酶的成熟形式(在一些實施方案中，該序列為主鏈序列)。圖2A示出了編碼本專利技術木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.24)。加粗的小寫體核苷酸示出了內含子序列。編碼信號序列的序列以粗體(大寫體)顯示。圖2B示出了編碼本專利技術木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.25)。編碼信號序列的序列以粗體(大寫體)顯示。圖2C示出了編碼本文稱為FveXyn4的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID No.2)。圖3A示出了本專利技術木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.28)。加下劃線的(小寫體)序列部分可表示N端信號肽可在酶成熟之被切割。以粗斜體示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通過翻譯后修飾被切割。在一些實施方案中，該序列為主鏈序列。圖3B示出了本專利技術木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.29)。以粗斜體示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通過翻譯后修飾被切割。該序列可為蛋白質的活性形式，并且可為蛋白質的一種活性形式。在本文中其可被稱為酶的成熟形式。在一些實施方案中，該序列為主鏈序列。圖3C示出了本文稱為FoxXyn2的木聚糖酶的多肽序列(SEQ ID No.3)。這是酶的另一種活性形式。在一些實施方案中，在本文中其可被稱為酶的成熟本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種酶，其中所述酶為GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相較于親本GH10木聚糖酶，所述酶或其片段具有提高的熱穩定性，所述親本GH10木聚糖酶已在以下位置中的兩處或更多處被修飾：7、33、79、217和298，其中編號基于FveXyn4(SEQ?ID?No.1)的氨基酸編號。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.01.31 GB 1401648.91.一種酶，其中所述酶為GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相較于親本GH10木聚糖酶，所述酶或其片段具有提高的熱穩定性，所述親本GH10木聚糖酶已在以下位置中的兩處或更多處被修飾：7、33、79、217和298，其中編號基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸編號。2.根據權利要求1所述的酶，其中所述親本GH10木聚糖酶已在以下位置中的三處或更多處被修飾：7、33、79、217和298。3.根據權利要求1或權利要求2所述的酶，其中所述親本GH10木聚糖酶已在至少以下位置處被修飾：7、33、79、217和298。4.一種具有木聚糖酶活性的酶，所述酶為GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，所述酶在以下位置中的兩處或更多處(合適地三處或更多處，合適地至少所有位置處)被修飾：7、33、79、217和298，其中所述編號基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸編號，并且相較于除所述修飾之外包含與所述酶相同的氨基酸序列的GH10木聚糖酶，所述酶具有提高的熱穩定性。5.根據前述權利要求中任一項所述的酶，其中所述修飾優選地選自以下項：N7D；T33V；K79Y、K79V、K79F、K79I、K79L或K79M(優選地K79Y、K79F或K79V，更優選地K79Y)；A217Q、A217E、A217P、A217D或A217M(優選地A217Q、A217E或A217P，更優選地A217Q)；和T298Y、T298F或T298W(優選地T298Y或T298F，更優選地T298Y)。6.根據權利要求1至3或5中任一項所述的酶，其中所述親本GH10木聚糖酶在以下位置中的一處或多處被進一步修飾：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。7.根據權利要求4或5中任一項所述的酶，其中所述酶在以下位置中的一處或多處具有進一步的修飾：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。8.根據權利要求6或權利要求7所述的酶，其中所述修飾選自以下項：N25P；S57Q、S57T或S57V(優選地S57Q)；N62T或N62S(優選地N62T)；G64T或G64S(優選地G64T)；S89G、S89N、S89Q、S89L或S89M(優選地S89G或S89Q，更優選地S89G)；T103M或T103K(優選地T103M)；V115E或V115L(優選地V115L)；N147Q；G181Q、G181A、G181D或G181P(優選地G181Q)；S193Y或S193N(優選地S193Y)；和/或G219D或G219P(優選地G219P)。9.根據前述權利要求中任一項所述的酶，其中所述修飾選自以下項：i.N7D、N25P、T33V、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；ii.N7D、N25P、T33V、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；iii.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；iv.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、K79Y、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；v.N7D、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；vi.K79F_A217Q_T298F；vii.N7D_T33V_A217Q_T298F；viii.N7D_K79F_T298F；ix.T33V_K79F_A217Q；x.N7D_T33V_T298Y；xi.T33V_A217Q_T298Y；xii.N7D_A217Q_T298F；xiii.N7D_T33V_A217Q；xiv.K79F_T298F；xv.N7D_K79F；xvi.T33V_K79F；xvii.T33V_T298Y；xviii.N7D_T33V；xix.T33V_A217Q。10.根據權利要求1至3或5至9中任一項所述的酶，其中所述親本GH10木聚糖酶為：a)包含選自以下項的氨基酸序列的木聚糖酶：SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5；或b)包含與SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少70％同一性(合適地至少80％，合適地至少90％，合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％同一性)的氨基酸序列的木聚糖酶；或c)由這樣的核苷酸序列編碼的木聚糖酶：所述核苷酸序列包含本文示出為SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或d)由這樣的核苷酸序列編碼的木聚糖酶：所述核苷酸序列包含與SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合適地至少80％，合適地至少90％，合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％同一性)的核苷酸序列；或e)由這樣的核苷酸序列編碼的木聚糖酶：所述核苷酸序列能夠在高嚴格條件下雜交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33。11.根據權利要求1至3或5至10中任一項所述的酶，其中所述親本GH10木聚糖酶能夠從鐮刀菌(Fusarium)生物體獲得(合適地獲自鐮刀菌(Fusarium)生物體)。12.一種酶，其中所述酶為GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，所述酶包含與GH10木聚糖酶(例如，親本GH10木聚糖酶)具有至少70％(合適地至少80％、合適地至少90％、合適地至少95％、合適地至少98％、合適地至少99％)同一性的多肽；并且所述酶在所指示位置中的兩處或更多處(合適地三處或更多處，合適地所有位置處)包含以下氨基酸：7D；33V；79Y、79V、79F、79I、79L或79M(優選地79Y、79F或79V，更優選地79Y)；217Q、217E、217P、217D或217M(優選地217Q、217E或217P，更優選地217Q)；以及298Y、298F或298W(優選地298Y或298F，更優選地298Y)，其中所述編號基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸編號。13.根據權利要求12所述的酶，其中所述酶在所指示位置處還包含以下氨基酸中的至少一種：25P；57Q、57T或57V(優選地57Q)；62T或62S(優選地62T)；64T或64S(優選地64T)；89G、89N、89Q、89L或89M(優選地89G或89Q，更優選地89G)；103M或103K(優選地103M)；115E或115L(優選地115L)；147Q；181Q、181A、181D或181P(優選地181Q)；193Y或193N(優選地193Y)；和/或219D或219P(優選地219P)。14.根據權利要求12至13中任一項所述的酶，其中所述酶在所指示位置處包含以下氨基酸：i.7D、25P、33V、64T、79Y、89G、217Q和298Y；ii.7D、25P、33V、79Y、89G、217Q和298Y；iii.7D、25P、33V、57Q、62T、64T、79Y、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；iv.7D、25P、33V、57Q、62T、79Y、89G、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；v.7D、33V、57Q、62T、64T、79Y、89G、217Q和298Y；vi.79F_217Q_和298F；vii.7D_33V_217Q_和298F；viii.7D_79F_和298F；ix.33V_79F_和217Q；x.7D_33V_和298Y；xi.33V_217Q_和298Y；xii.7D_217Q和_298F；xiii.7D_33V_和217Q；xiv.79F和_298F；xv.7D_和79F；xvi.33V_和79F；xvii.33V_和298Y；xviii.7D_和33V；或xix.33V_和217Q。15.根據前述權利要求中任一項所述的酶，其中所述酶包含與SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少94％(合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％)同一性的多肽；或者包含與由這樣的核苷酸序列編碼的木聚糖酶具有至少94％(合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％)同一性的多肽：所述核苷酸序列包含本文示出為SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或者包含與由這樣的核苷酸序列編碼的木聚糖酶具有至少94％(合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％)同一性的多肽：所述核苷酸序列能夠在高嚴格條件下雜交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33。16.根據前述權利要求中任一項所述的酶，其中所述木聚糖酶為內切-1,4-β-d-木聚糖酶。17.根據前述權利要求中任一項所述的酶，其中所述酶具有大于70℃(優選地大于75℃)的Tm值，其中所述Tm值被測量為10分鐘溫育后得到50％殘余活性時的溫度。18.根據前述權利要求中任一項所述的酶，其中所述酶的最適pH在4.6至7的范圍內，優選地為約5至6。19.根據權利要求1至17中任一項所述的酶，其中所述酶a)包含本文示出為SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的所述氨基酸序列中的一者，或b)包含與本文示出為SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的氨基酸序列具有至少96％、優選地至少98.5％同一性的氨基酸序列，只要位置7、33、79、217和298處的氨基酸與SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21中所示的那些氨基酸相同即可。20.一種編碼根據前述權利要求中任一項所述的酶的核酸分子((例如分離的或重組的核酸分子)。21.一種編碼熱穩定性木聚糖酶并包含主鏈多核苷酸序列(或由所述主鏈多核苷酸序列組成)的核酸分子(例如分離的或重組的核酸分子)，所述主鏈多核苷酸序列包含選自以下項的核苷酸序列：a.在本文示出為SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或b.與SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合適地至少80％，合適地至少90％，合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％同一性)的核苷酸序列；或c.能夠在高嚴格條件下雜交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；其中所述主鏈多核苷酸序列在所編碼多肽中的密碼子編碼氨基酸的以下位置中的兩處或更多處被修飾：7、33、79、217和298，其中所述編號基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸編號。22.根據權利要求21所述的核酸分子，其中所述主鏈多核苷酸序列在所述密碼子編碼氨基酸的以下位置中的三處或更多處被修飾：7、33、79、217和298。23.根據權利要求21或權利要求22所述的核酸分子，其中所述主鏈多核苷酸序列在所述密碼子編碼氨基酸的至少以下位置處被修飾：7、33、79、217和298。24.一種包含主鏈多核苷酸序列(或由所述主鏈多核苷酸序列組成)的載體(例如質粒)或構建體，所述主鏈多核苷酸序列包含根據權利要求20至23中任一項所述的核苷酸序列，或包含選自以下項的核苷酸序列：a.在本文示出為SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或b.與SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合適地至少80％，合適地至少90％，合適地至少95％，合適地至少98％，合適地至少99％同一性)的核苷酸序列；或c.能夠在高嚴格條件下雜交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；其中所述主鏈多核苷酸序列在所編碼多肽中的密碼子編碼氨基酸的以下位置中的兩處或更多處被修飾：7、33、79、217和298，其中所述編號基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸編號。25.根據權利要求24所述的載體(例如質粒)或構建體，其中所述主鏈多核苷酸序列在所述密碼子編碼氨基酸的以下位置中的三處或更多處被修飾：7、33、79、217和298。26.根據權利要求24或權利要求25所述的載體(例如質粒)或構建體，其中所述主鏈多核苷酸序列在所述密碼子編碼氨基酸的至少以下位置處被修飾：7、33、79、217和298。27.根據權利要求20至23中任一項所述的核酸分子或根據權利要求24至26中任一項所述的載體或構建體，其中所述多核苷酸序列在所指示位置處包含編碼以下氨基酸的密碼子：7D；33V；79F、79V、79Y、79I、79L或79M(優選地79F、79Y或79V，更優選地79Y)；217Q、217E、217P、217D或217M(優選地217Q、217E或217P，更優選地217Q)；和298Y、298F或298W(優選地298Y或298F，更優選地298Y)。28.根據權利要求20至23或權利要求27中任一項所述的核酸分子或根據權利要求24至27中任一項所述的載體或構建體，其中所述主鏈多核苷酸序列在編碼以下位置處氨基酸的一種或多種密碼子上被進一步修飾：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。29.根據權利要求28所述的核酸分子或根據權利要求27所述的載體或構建體，其中所述進一步修飾能夠在所述編碼的氨基酸序列中的所指示位置處提供下列...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·H·洛倫森，S·阿蘭特倫德，I·尼古拉耶夫，J·亨德里克阿范圖埃爾，B·科普斯，
申請(專利權)人：杜邦營養生物科學有限公司，
類型：發明
國別省市：丹麥;DK