有機磷水解酶變體制造技術

本發明專利技術涉及有機磷水解酶變體。本發明專利技術還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包括這些多核苷酸的核酸構建體、載體以及宿主細胞；以及使用這些變體的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】序列表的引用本申請包括計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。背景專利技術領城本專利技術涉及有機磷水解酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產生這些變體的方法以及使用這些變體的方法。相關領域描述本領域已知有機磷化合物。特別地，眾所周知一些戰劑是有機磷化合物，例如G-型神經藥劑，例如薩林(Sarin)、環薩林(Cyclosarin)、和索曼(Soman)，以及V-型神經藥劑，例如VX。其他有機磷化合物作為殺有害生物劑為人所知。希望的是能夠凈化被上述有機磷化合物污染的區域。已提出將具有有機磷水解酶活性如二異丙基氟磷酸酶(diisopropylfluoirophosphatase)活性的多肽用于此目的，因為此類多肽能夠水解有害的有機磷化合物并由此將其轉化為有害性較低的產物。在WO 99/43791中披露了一種來自歐洲烏賊(Loligo vulgaris)的二異丙基氟磷酸酶并且還描述了其除其他應用之外的用于凈化的潛在用途。WO 2009/130285、WO 2010/128115和WO 2010/128116披露了來自假交替單胞菌(Pseudoalteramonas haloplanktis)、章魚(Octopus vulgaris)、和加州海兔(Aplysia californica)的其他二異丙基氟磷酸酶。本專利技術提供了與其親本相比具有改進的特性的有機磷水解酶變體。專利技術概述本專利技術涉及有機磷水解酶變體，這些變體在與SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312相對應的一個或多個(例如，若干個)位置處包括取代，其中這些變體具有有機磷水解酶活性。本專利技術還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包括這些多核苷酸的核酸構建體、載體以及宿主細胞；以及生產這些變體的方法。本專利技術還涉及凈化暴露于有機磷化合物像神經毒氣、毒素、或殺有害生物劑的環境或表面的方法。定義有機磷水解酶：術語“有機磷水解酶”在此定義為對有機磷化合物，特別是有機磷化合物(包括神經毒氣)中的磷酐鍵的水解活性。因此，該術語包括具有水解酶活性和/或酯酶活性例如有機磷水解酶活性(例如有機磷酯酶活性)或有機磷酸脫水酶(OPAA)活性、或羧酸酯酶活性、二異丙基氟磷酸酶(DFP酶)活性(EC 3.1.8.2)、脫鹵素酶活性、催化磷-硫鍵的水解的、具有脯氨酸肽酶活性和/或亞氨基二肽酶活性的酶。術語“DFP酶”(EC3.1.8.2)在此被定義為二異丙基氟磷酸酶、二烷基氟磷酸酶、二異丙基氟磷酸水解酶、二異丙基氟磷酸脫鹵素酶、二異丙基磷氟化酶(diisopropylphosphofluoridase)、異丙基磷氟化酶(isopropylphosphorofluoridase)、有機磷酸酯酸脫水酶、有機磷酸脫水酶、索曼分解酶、塔崩酶。DFP酶作用于有機磷化合物(包括神經毒氣)中的磷酐鍵(例如磷-鹵化物以及磷-氰化物)。出于本專利技術的目的，根據實例2中所述的程序確定有機磷水解酶活性。在一個方面中，本專利技術的這些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的有機磷水解酶活性。凈化：術語“凈化”在此應被理解為去除、分解或破壞有害藥劑，例如有機磷化合物，例如神經毒氣、毒素、殺有害生物劑，從而該術語包括例如解毒活性。等位基因變體：術語“等位基因變體”意指占用同一染色體位點的一種基因的兩個或更多個替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產生，并且可以導致群體內的多態性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。cDNA：術語“cDNA”意指可以通過從得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子進行反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應基因組DNA中的內含子序列。早先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的步驟進行加工，包括剪接。編碼序列：術語“編碼序列”意指直接指明變體的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。控制序列：術語“控制序列”意指對于表達編碼本專利技術的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生(native)的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列以及轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。表達：術語“表達”包括涉及變體產生的任何步驟，包括但不限于，轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。表達載體：術語“表達載體”意指線性或環狀DNA分子，該分子包括編碼變體的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達的控制序列相連接。片段：術語“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(例如，若干個)氨基酸的多肽；其中該片段具有有機磷水解酶活性。在一方面，該片段包含至少290個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸24至313)、至少300個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸24至323)、或至少308個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸24至331)。高嚴格條件：術語“高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。宿主細胞：術語“宿主細胞”意指易于用包含本專利技術的多核苷酸的核酸構建體或表達載體轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語“宿主細胞”涵蓋由于復制期間發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。改進的活性：術語“改進的活性”意指與親本，例如，如在實例中描述的相比而言改進的變體的有機磷水解酶活性。分離的：術語“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環境中的物質。分離的物質的非限制性實例包括(1)任何非天然存在的物質；(2)至少部分地從與其在自然界中相關聯的一種或多種或全部天然存在的組分中除去的任何物質，包括但不局限于任何酶、變體、核酸、蛋白質、肽或輔因子；(3)相對于自然界中發現的那種物質通過人工手動修飾的任何物質；或者(4)通過相對于與其天然相關聯的其他組分增加該物質的量而修飾的任何物質(例如，編碼該物質的基因的多個拷貝；比與編碼該物質的基因天然相關聯的啟動子更強的啟動子的使用)。一種分離的物質可以存在于發酵液樣品中。低嚴格條件：術語“低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種有機磷水解酶變體，包括在與SEQ?ID?NO:2的成熟多肽的位置K34、D37、D38、P58、G59、R61、D63、D91、I94、C96、M111、E164、F165、K166、M167、F169、Q170、E171、R193、F194、T216、R219、D243、E245、Q246、E247、G248、P250、W266、D290、K291、S293、和N312，優選位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312相對應的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有有機磷水解酶活性，并且其中該變體與SEQ?ID?NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.11.28 EP 13194860.61.一種有機磷水解酶變體，包括在與SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置K34、D37、D38、P58、G59、R61、D63、D91、I94、C96、M111、E164、F165、K166、M167、F169、Q170、E171、R193、F194、T216、R219、D243、E245、Q246、E247、G248、P250、W266、D290、K291、S293、和N312，優選位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312相對應的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有有機磷水解酶活性，并且其中該變體與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。2.如權利要求1所述的變體，該變體是親本有機磷水解酶的變體，該親本有機磷水解酶選自下組，該組由以下各項組成：(a)與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由如下的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在低嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、或(ii)(i)的全長互補體雜交；(c)由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％一致性的多核苷酸編碼的多肽；以及(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，該片段具有有機磷水解酶活性。3.如權利要求1所述的變體，該變體是親本有機磷水解酶的變體，該親本有機磷水解酶選自下組，該組由以下各項組成：(a)與SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由如下的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在低嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列、或(ii)(i)的全長互補體雜交；(c)由與SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列具有至少60％一致性的多核苷酸編碼的多肽；以及(d)SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段，該片段具有有機磷水解酶活性。4.如權利要求2所述的變體，其中該親本有機磷水解酶與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。5.如權利要求3所述的變體，其中該親本有機磷水解酶與SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。6.如權利要求2所述的變體，其中該親本有機磷水解酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其組成。7.如權利要求2所述的變體，其中該親本有機磷水解酶是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其中該片段具有有機磷水解酶活性。8.如權利要求3所述的變體，其中該親本有機磷水解酶包括SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其組成。9.如權利要求3所述的變體，其中該親本有機磷水解酶是SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段，其中該片段具有有機磷水解酶活性。10.如權利要求2-9中任一項所述的變體，該變體與該親本有機磷水解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。11.如權利要求1-10中任一項所述的變體，其中取代的數目是1-20個，例如1-10和1-5個，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個改變。12.如權利要求1-11中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置P58的位置處的取代；優選地，該取代是Ala、Gly、Met、Ser、或Val。13.如權利要求1-12中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置R61的位置處的取代；優選地，該取代是Ile、Leu、Asn、Pro、或Val。14.如權利要求1-13中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置F165的位置處的取代；優選地，該取代是Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Ser、或Val。15.如權利要求1-14中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置M167的位置處的取代；優選地，該取代是Ala、Gly、Ile、Ser、或Val。16.如權利要求1-15中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置R193的位置處的取代；優選地，該取代是Asn或Gln。17.如權利要求1-16中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置P250的位置處的取代；優選地，該取代是Ala、Gly、Ile、或Met。18.如權利要求1-17中任一項所述的變體，該變體包括在對應于位置N312的位置處的取代；優選地，該取代是Asp。19.如權利要求1-18中任一項所述的變體，該變體在與位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相對應的兩個位置處包括取代。20.如權利要求1-19中任一項所述的變體，該變體在與位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相對應的三個位置處包括取代。21.如權利要求1-20中任一項所述的變體，該變體在與位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相對應的四個位置處包括取代。22.如權利要求1-21中任一項所述的變體，該變體在與位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相對應的五個位置處包括取代。23.如權利要求1-22中任一項所述的變體，該變體在與位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相對應的六個位置處包括取代。24.如權利要求1-23中任一項所述的變體，該變體在與位置P58、R61、M167、F165、R193、P250、和N312相對應的每個位置處包括取代。25.如權利要求1-24中任一項所述的變體，該變體包括與選自下組的取代相對應的一個或多個取代，該組由以下各項組成：K34A、D37A、D37N、D37S、D37T、D38A、D38E、D38N、P58A、P58G、P58M、P58S、P58V、G59A、G59P、G59S、G59T、R61I、R61L、R61N、R61P、R61V、D63E、D63N、D63R、D91N、D91S、D91T、I94A、I94F、I94G、I94V、C96A、C96G、M111A、M111G、E164A、E164P、F165A、F165G、F165I、F165L、F165M、F165S、F165V、K166S、K166T、M167A、M167G、M167I、M167S、M167V、F169I、F169L、F169V、F169W、F169Y、Q170D、Q170E、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：B·G·漢森，L·K·斯科烏，L·德瑪利亞，J·B·蘭內斯，
申請(專利權)人：諾維信公司，
類型：發明
國別省市：丹麥;DK