賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑制造技術

本發明專利技術公開了一種賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種或多種混合物；所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥
，具體涉及一種改善賴氨酰肽鏈內切酶穩定性的凍干及貯存保護劑以及酶溶液保護劑。
技術介紹
賴氨酰肽鏈內切酶(Lysyl Endopeptidase，Lep)，EC3.4.21.50，分子量約為30KD，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員之一，能特異切割肽鏈中賴氨酸殘基或氨乙基半胱氨酸C端的肽鍵，能顯著提高酶切轉化率和純度，故常用于蛋白質序列分析中的質譜分析和Lys-X的化合物酶催化合成。目前表達Lep的野生菌有銅綠假單胞菌，促溶無色桿菌和產酶溶桿菌。產酶溶桿菌產酶比無色桿菌活性高，本專利技術所用菌株為促溶無色桿菌M497-1(ATCC 21456)，從美國模式菌種保藏中心購得。酶的發酵和純化步驟參考文獻方法(Masaki T,Tanabe M,Nakamura K,et al.Studies on a new proteolytic enzyme from Achromobacter lyticus M497-1I.Purification and some enzymatic properties[J].Biochimica Et Biophysica Acta,1981,660(1):44-50)。純化得到Lep之后，對其凍干處理是長期保存此酶的重要方法。但凍干過程牽涉到復雜的相變過程，在凍結、凍融干燥、儲存過程中，存在多種誘導蛋白變性的因素，又因該酶自身的氨基酸序列中含有賴氨酸殘基，因此在凍干和溶液保存時，易失活或自身酶切，故需要開發新的方法以提高其穩定性。專利CN102973526A公開人抗凝血酶制劑冷凍干燥過程中的保護劑，包括使用蔗糖、賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸的一種進行保護。專利CN101893639A公開了穩定血清α-羥丁酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性的方法，使用了牛血清蛋白、海藻糖(或蔗糖)、甘露醇和甘氨酸作為保護劑進行凍干。盡管添加糖類和氨基酸作為保護劑用于制備酶制劑已屬公知技術，但是由于酶結構組成的千差萬別，目前尚沒有一種可以直接套用的保護劑組成進行各種酶的保護，因此，針對具體酶而言為改善其穩定性，仍需要大量的試驗進行保護劑的篩選。文獻檢索表明：目前尚沒有已經公開一種穩定的賴氨酰肽鏈內切酶混合物和方法。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是，解決賴氨酰肽鏈內切酶在凍干過程中和溶液狀態保存時的自身酶解問題，最大程度地提高酶的穩定性，滿足長期貯存的需要。本專利技術提供了一種賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種或多種混合物；所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％。其中，優選地，所述的保護劑的pH為4～10。其中，優選地，所述的保護劑還包括PBS緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。優選地，所述的保護劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽的一種。優選地，所述的保護劑pH為5或10。進一步優選地，所述的保護劑選擇如下混合物，蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；乳糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；乳糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物；海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。優選地，所述的混合物的成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1％。進一步優選地，所述的保護劑選自如下優選地的混合物，乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物；蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。優選地，所述的保護劑pH為5-10。優選地，所述的保護劑選自的混合物，所述由兩種成分組成的混合物中的成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％，0.5％，1％，2.5％或5％。其中，優選地，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.5％，甘氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1％；所述右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.5％，甘氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.5％。本專利技術還涉及一種賴氨酰肽鏈內切酶的凍干劑，其特征在于，包括如下組分：如上所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％；和賴氨酰肽鏈內切酶，所述的賴氨酰肽鏈內切酶酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.0001％-0.02％。優選地，所述的凍干劑的pH為4～10。另一方面，一種賴氨酰肽鏈內切酶的貯存溶液，包括如下組分：如上所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％；和賴氨酰肽鏈內切酶，所述的賴氨酰肽鏈內切酶在酶貯存溶液中的質量體積百分濃度為0.0001％-0.02％。所述的保護劑選用蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶貯存溶液中的質量體積百分濃度為1％。上述混合物，是所述物質包含兩種或多種成分的組成物。上述的兩種成分組成的混合物，包括但不限于上述的蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物及海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。上述的酶凍干溶液，是賴氨酰肽鏈內切酶的凍干前的最終溶液。上述的酶貯存溶液，是賴氨酰肽鏈內切酶貯存時的溶液。附圖說明圖1是十肽底物在賴氨酰肽鏈內切酶的酶切產物的液相分析。其中，底物峰保留時間為14.3min；酶切底物后，產物1保留時間分別是6.8min，產物21保留時間是3.3min。具體實施方式為使本專利技術的上述目的、特征和優點能夠更為明顯易懂，下面結合附圖
對本專利技術的具體實施方式做詳細的說明。所述的“包括”表示本專利技術的保護劑除了含有所述成分如蔗糖，海藻糖，乳糖等或組合物等，還可以包含一些用于調整保護劑pH的物質，如用于調整保護劑pH的緩沖液等。根據本申請的某些實施方式，所述保護劑包括蔗糖，甘氨酸或其鹽，甘露醇等單一成分，也包括由蔗糖、甘氨酸或其鹽、賴氨酸或其鹽、聚乙二醇4000和右旋糖酐其中三種成分組成的混合物，及包括由甘氨酸或其鹽、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷其中兩種成分組成的混合物；例如，保護劑為蔗糖，海藻糖，甘氨酸或其鹽，甘露醇，右旋糖酐，聚乙二醇4000，乳糖，賴氨酸或其鹽及蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合本文檔來自技高網...

【技術保護點】
賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述保護劑的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種或多種混合物；所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％。

【技術特征摘要】
1.賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述保護劑的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種或多種混合物；所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％。2.如權利要求1所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護劑的pH為4～10。3.如權利要求1或2所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護劑還包括PBS緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。4.如權利要求1-3任一項所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽的一種。5.如權利要求4所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護劑pH為5或10。6.如權利要求1或2所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護劑選擇如下混合物，蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；乳糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；乳糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物；海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。7.如權利要求6所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的混合物的成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1％。8.如權利要求6或7所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳勇，徐一帆，李亞茹，
申請(專利權)人：上海多米瑞生物技術有限公司，上海醫藥工業研究院，
類型：發明
國別省市：上海;31