本發明專利技術涉及新的蛋白檢測方法、以及相應的蛋白檢測試劑盒。具體而言，本發明專利技術涉及改良的雙縮脲比色法，通過采用直鏈烷基硫酸鈉和氫氧化鈉的水溶液作為試劑A，并采用硫酸銅或水合硫酸銅、酒石酸鈉和氫氧化鈉的水溶液作為試劑B，從而能夠適用于對含有溶解性差的蛋白的樣品中的蛋白含量進行快速、準確的測定。同時，本發明專利技術所述的蛋白檢測試劑盒具有配制簡單、成本低廉和保質期長等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及利用生化方法對食品、飼料等中的蛋白進行檢測的方法及相應的蛋白檢測試劑盒。
技術介紹
天然動、植物中的蛋白依其溶解特性，一般可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四大類。其中，只有清蛋白具有良好的水溶性，其它三種蛋白只有在鹽、醇、稀酸和/或堿的存在下才能溶于水相。并且，食品或飼料原料中的蛋白還常常由于加工過程中的加熱處理或化學反應等操作而在結構和溶解性方面發生變化，造成其溶解性進一步變差。《食品安全國家標準GB5009.5-2010--食品中蛋白質的檢測》以及《GB/T 6432-1994--飼料中粗蛋白檢測方法》中公開的蛋白檢測方法主要包括：凱氏定氮法(第一法)、分光光度法(第二法)和燃燒法(第三法)。其中，前兩種方法均需先將蛋白消化分解，再通過滴定或顯色方法測定所產生的氨的含量，并進一步通過換算得出蛋白總量。所述第一法使用最為廣泛，然而由于采用消化步驟和蒸餾步驟，檢測所需時間較長(一般為2-4小時)。就所述第二法而言，雖然總體檢測時間相對縮短，但由于仍需存在消化步驟(耗時約1小時或更長)，使用該方法進行檢測仍然不夠快捷。燃燒法是一種較新的快速蛋白檢測方法，該方法通過使樣品在高溫下燃燒生成氮氣，從而測定蛋白總量，然而該方法所需設備及日常消耗成本均較高，且樣品檢測通量較低，對于大批量的蛋白樣品檢測并不適用。除了上述中國國家標準中描述的檢測方法，生化實驗室中還常采用雙縮脲法、BCA法、考馬斯亮藍法、Lowry法和紫外吸收法等生化檢測方法來測定蛋白含量。這些方法通過在化學顯色后進行比色或者直接進行比色來檢測純度較高的蛋白樣品中的蛋白含量，而無需消化步驟，因此，能夠顯著縮短檢測時間。然而，上述方法均要求樣品中的蛋白充分溶解，并且要求顯色體系澄清、對光路無干擾。此外，上述方法還存在如下缺點：例如，考馬斯亮藍法對測試樣品中的蛋白分子大小有更多限
制；紫外吸收法基于蛋白中的芳香族氨基酸殘基在280nm下的光吸收值進行檢測，由于不同蛋白中的芳香族氨基酸的含量不同，該方法的檢測準確性和專一性不好；同時，對于傳統的雙縮脲法、BCA法和Lowry法而言，并不適用于對含有溶解性差的醇溶蛋白和谷蛋白的谷物樣品以及大部分動、植物工業衍生品中的蛋白含量進行檢測。而且，待測樣品體系中存在的淀粉、脂類以及纖維等成分也會影響上述實驗室方法的檢測準確度。因此，上述實驗室方法很難達到國家標準中對蛋白含量檢測的準確度要求。對于溶解性差的蛋白，雖然可以通過添加大量的變性劑(如尿素、胍鹽或十二烷基硫酸鈉)來增高溶解度。然而，這些變性劑并不能與雙縮脲法、BCA法和Lowry法兼容。經典的雙縮脲試劑主要由硫酸銅、酒石酸鉀鈉和氫氧化鈉等組成，為了解決鉀與十二烷基硫酸鹽反應形成沉淀以及碘所引起的雙縮脲試劑不穩定的問題，Watters C.提出了主要由硫酸銅、酒石酸鈉和氫氧化鈉等組成的改良雙縮脲試劑，其中，1L該改良試劑中含有1.5g的CuSO4·5H2O、4.9g的Na2C4H4O6·2H2O和7.5g的NaOH，測定樣品中的蛋白含量時，將0.5mL含2％(w/v)去污劑的可溶的樣品加入至2.5mL改良雙縮脲試劑中(參見Watters C.，1978年，A one-step biuret assay for protein in the presence of detergent，Analytical Biochemistry，88(2):695-8)。也就是說，Watters C.所提出的改良雙縮脲試劑可與十二烷基硫酸鈉(2％，w/v)相兼容，然而該方法符合Lambert-Beer定律的線性范圍較窄(待測樣品中的蛋白濃度需滿足0.4-8mg/mL)，這增高了待測樣品稀釋重測的工作量。此外申請人經實驗驗證發現，采用Watters C.改良雙縮脲試劑對如玉米、小麥等谷物及其工業衍生品中的蛋白含量進行測定時，雖然該試劑中含有更高濃度的十二烷基硫酸鈉，但是仍然存在由于比色液混濁而無法直接測定其中的蛋白含量的問題，而在除去不溶物質后，樣品通過顯色得到的測定結果往往與通過凱氏定氮法得到的檢測結果之間差距很大(相對標準偏差RSD>40％)。因此，本領域迫切需要開發出既能夠保證測定結果準確度，同時還具有測定所需時間短、適用測定對象范圍寬(尤其是能夠直接用于對含
有難溶蛋白的樣品中的蛋白含量進行測定)等優點的蛋白檢測方法、以及相應的蛋白檢測試劑盒。
技術實現思路
本專利技術人通過研究首次發現，通過采用特定濃度的直鏈烷基硫酸鈉與氫氧化鈉預先混合，并對待測蛋白樣品進行兩次特定的加熱，從而能夠明顯提高難溶蛋白等各種蛋白樣品的溶解度，并能夠改善待測樣品的澄清度，使得對該待測樣品進行的吸光度測量更加準確，從而減小測量偏差。因此，在一方面，本專利技術提供了一種蛋白檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)制備試劑A和試劑B：使直鏈烷基硫酸鈉和氫氧化鈉溶于水中至摩爾濃度分別為45-100mM和150-300mM，得到所述試劑A；將硫酸銅或水合硫酸銅、酒石酸鈉和氫氧化鈉依次溶于水中至摩爾濃度分別為5-10mM、15-30mM和150-750mM，得到所述試劑B；(2)制備樣品：使用不含蛋白的水或者緩沖液作為空白樣品；將牛血清白蛋白溶于水或緩沖液中，并對該蛋白的濃度進行調整，從而得到蛋白濃度處于0.2mg/mL-30mg/mL范圍內的一系列溶液，作為標準蛋白樣品；將含蛋白的待測原料分散于或溶于水或緩沖液中，并通過任選的稀釋處理制成待測樣品；(3)將步驟(1)中制備的試劑A分別與步驟(2)中制備的空白樣品、標準蛋白樣品、待測樣品等體積混合，得到相應的試劑A混合物，其中，所述待測樣品的試劑A混合物中的蛋白含量符合線性范圍的要求，并將各試劑A混合物在溫度為90-100℃的水浴中加熱后，取出冷卻至室溫；(4)將步驟(3)中得到的各試劑A混合物分別與步驟(1)中制備的試劑B混合，得到相應的試劑B混合物，并將各試劑B混合物在溫度為50-70℃的水浴中加熱后，取出冷卻至室溫；(5)對步驟(4)中冷卻后的各試劑B混合物進行過濾，以步驟(4)中冷卻后的空白樣品的試劑B混合物作為參比，使用分光光度計在540nm下測定步驟(4)中冷卻后的標準蛋白樣品的試劑B混合物和待測
樣品的試劑B混合物的吸光度；(6)根據步驟(3)中的標準蛋白樣品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通過線性擬合得出蛋白含量與吸光度之間的關系，并通過如下的方程式(ii)計算得出步驟(2)中所述的待測樣品中的蛋白含量：(i)標準蛋白樣品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；(ii)待測樣品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×2×D，其中，K、C為擬合常數，D＝步驟(2)中制備待測樣品時的稀釋倍數。在第二方面，本專利技術提供了蛋白檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含試劑A和試劑B：其中，所述試劑A為45-100mM直鏈烷基硫酸鈉和150-300mM氫氧化鈉的水溶液；所述試劑B為5-10mM硫酸銅或水合硫酸銅、15-30mM酒石酸鈉和150-750mM氫氧化鈉的水溶液。具體而言，本專利技術可通過如下述段落[1]-[40]中的任一段所述的技術方案加以實現：[1].一種蛋白檢測方法，其特征在于，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蛋白檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)制備試劑A和試劑B：使直鏈烷基硫酸鈉和氫氧化鈉溶于水中至摩爾濃度分別為45?100mM和150?300mM，得到所述試劑A；將硫酸銅或水合硫酸銅、酒石酸鈉和氫氧化鈉依次溶于水中至摩爾濃度分別為5?10mM、15?30mM和150?750mM，得到所述試劑B；(2)制備樣品：使用不含蛋白的水或者緩沖液作為空白樣品；將牛血清白蛋白溶于水或緩沖液中，并對所述蛋白的濃度進行調整，從而得到蛋白濃度處于0.2mg/mL?30mg/mL范圍內的一系列溶液，作為標準蛋白樣品；將含蛋白的待測原料分散于或溶于水或緩沖液中，并通過任選的稀釋處理制成待測樣品；(3)將所述步驟(1)中制備的試劑A分別與所述步驟(2)中制備的空白樣品、標準蛋白樣品、待測樣品等體積混合，得到相應的試劑A混合物，其中，所述待測樣品的試劑A混合物中的蛋白含量符合線性范圍的要求，將各試劑A混合物在溫度為90?100℃的水浴中加熱后，取出冷卻至室溫；(4)將所述步驟(3)中得到的各試劑A混合物分別與所述步驟(1)中制備的試劑B混合，得到相應的試劑B混合物，并將各試劑B混合物在溫度為50?70℃的水浴中加熱后，取出冷卻至室溫；(5)對所述步驟(4)中冷卻后的各試劑B混合物進行過濾，以所述步驟(4)中冷卻后的空白樣品的試劑B混合物作為參比，使用分光光度計在540nm下測定所述步驟(4)中冷卻后的標準蛋白樣品的試劑B混合物和待測樣品的試劑B混合物的吸光度；(6)根據所述步驟(3)中的標準蛋白樣品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通過線性擬合得出蛋白含量與吸光度之間的關系，并通過如下的方程式(ii)計算得出所述步驟(2)中所述的待測樣品中的蛋白含量：(i)標準蛋白樣品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；(ii)待測樣品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×2×D，其中，K、C為擬合常數，D＝所述步驟(2)中制備待測樣品時的稀釋倍數。...
【技術特征摘要】
1.一種蛋白檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)制備試劑A和試劑B：使直鏈烷基硫酸鈉和氫氧化鈉溶于水中至摩爾濃度分別為45-100mM和150-300mM，得到所述試劑A；將硫酸銅或水合硫酸銅、酒石酸鈉和氫氧化鈉依次溶于水中至摩爾濃度分別為5-10mM、15-30mM和150-750mM，得到所述試劑B；(2)制備樣品：使用不含蛋白的水或者緩沖液作為空白樣品；將牛血清白蛋白溶于水或緩沖液中，并對所述蛋白的濃度進行調整，從而得到蛋白濃度處于0.2mg/mL-30mg/mL范圍內的一系列溶液，作為標準蛋白樣品；將含蛋白的待測原料分散于或溶于水或緩沖液中，并通過任選的稀釋處理制成待測樣品；(3)將所述步驟(1)中制備的試劑A分別與所述步驟(2)中制備的空白樣品、標準蛋白樣品、待測樣品等體積混合，得到相應的試劑A混合物，其中，所述待測樣品的試劑A混合物中的蛋白含量符合線性范圍的要求，將各試劑A混合物在溫度為90-100℃的水浴中加熱后，取出冷卻至室溫；(4)將所述步驟(3)中得到的各試劑A混合物分別與所述步驟(1)中制備的試劑B混合，得到相應的試劑B混合物，并將各試劑B混合物在溫度為50-70℃的水浴中加熱后，取出冷卻至室溫；(5)對所述步驟(4)中冷卻后的各試劑B混合物進行過濾，以所述步驟(4)中冷卻后的空白樣品的試劑B混合物作為參比，使用分光光度計在540nm下測定所述步驟(4)中冷卻后的標準蛋白樣品的試劑B混合物和待測樣品的試劑B混合物的吸光度；(6)根據所述步驟(3)中的標準蛋白樣品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通過線性擬合得出蛋白含量與吸光度之間的關系，并通過如下的方程式(ii)計算得出所述步驟(2)中所述的待測樣品中的蛋白含量：(i)標準蛋白樣品中的蛋白...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉澤龍，熊小輝，孟繁麗，孫本軍，強婉麗，楊佳，
申請(專利權)人：中糧集團有限公司，中糧營養健康研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11
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