一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種包含特異結合人瘦素蛋白leptin的核酸適體的試劑盒。本發明專利技術提供的核酸適體，與人瘦素蛋白具有較好的親和能力。利用本發明專利技術的核酸適體，可以捕獲溶液中的人瘦素蛋白，將其制備成為相應的試劑盒，將用于眼病的篩查。利用本發明專利技術的試劑盒，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
格雷夫斯病(Graves'disease)是一種常見病，女性發病率為1/1000人/年。除甲狀腺功能亢進以外，25-50％患有格雷夫斯病的個體病情發展到在臨床上累及眼睛，即甲狀腺眼病。格雷夫斯眼病(Graves'Ophthalmopathy,GO或TAO)是甲狀腺眼病的典型形式。雖然一些GO患者只患有輕微的眼睛不適，但是3-5％患有劇烈疼痛和炎癥伴有復視乃至視力喪失。目前由于本病原因未明，臨床主要以激素、免疫抑制劑、生長激素類似物、抗甲狀腺藥物、眶內放射、眼眶減壓術等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今為止尚無任何一種藥物能有效治療TAO，并獲長期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關眼病的藥物是亟待解決的技術問題。而檢測所述疾病更是本領域積極研究的方向。近年來的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)對TAO患者眼眶前脂肪成纖維細胞增殖、移行以及細胞分化過程中細胞內脂質形成具有重要的作用。因此，檢測人瘦素蛋白的表達情況，可以直接用于鑒定甲狀腺相關眼病。然而傳統的檢測人瘦素蛋白的表達情況具有操作復雜，費時的缺點。核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結合某種生物革El標的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數富集配體系統進化技術(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結合靶標分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適體的靶標包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質、細胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當甚至更強的靶標識別能力，但與抗體相比具有很多優良的特性，如分子量小，能批量生產，不易失活，無免疫原性、容易合成與標記、快速的穿透組織、良好的代謝動力學、不同批次之間產品不會存在差異和具有很好化學穩定性，在生物檢測、疾病診斷治療等領域具有重要的應用前景。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種特異結合leptin的核酸適體及其試劑盒。本專利技術提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。所述核酸適體與leptin蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；b)將所述核酸適體進行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。所述核酸適體可用于制備檢測leptin的試劑盒。利用本專利技術的核酸適體，可以捕獲血液中的leptin，從而用于甲狀腺相關眼病篩查。利用本專利技術的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲leptin進行檢測，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優點。本專利技術具有很高的應用價值。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、核酸適體的篩選和制備設計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括39個核苷酸的隨機核酸文庫如下：5’-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’；N39代表39個隨機核苷酸。將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA,產物經2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。75μg RNA文庫經硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然后與2ug leptin蛋白(利用CN100366738C公開的方法，表達得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉錄出RNA適配子庫，篩選共進行12輪。得到了15個適配子，其序列分別為SEQ ID NO:1-15所示。具體序列如下所示：leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:1)leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:2)leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:3)leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:4)leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:5)leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:6)leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:7)leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:8)leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:9)leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:10)leptin-11：TAGAC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于眼科疾病檢測的試劑盒，其含有核酸適體。

【技術特征摘要】
1.一種用于眼科疾病檢測的試劑盒，其含有核酸適體。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸適體為SEQ ID No：12所述。3...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李倩，
申請(專利權)人：李倩，
類型：發明
國別省市：江蘇;32