一種ST2定量檢測方法及試劑盒技術

本發明專利技術公開了一種ST2定量檢測方法及試劑盒，屬于臨床診斷和生物科學領域。本發明專利技術的檢測方法為競爭法膠乳增強比濁檢測ST2，該方法使用膠乳偶聯的ST2與樣本中的ST2競爭結合ST2抗體從而引起濁度變化，推算ST2含量。本發明專利技術的試劑盒包括試劑1和試劑2，其中，試劑1中的組分包括緩沖液、ST2抗體、促凝劑、防腐劑。試劑2中的組分包括緩沖液、膠乳微球偶聯的ST2、穩定劑、防腐劑。該方法及試劑盒靈敏度高，特異性強，反應速度高，可直接應用于全自動生化分析儀，有利于臨床推廣及應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于臨床診斷和生物科學
，具體的，本專利技術提供了一種ST2定量檢測試劑盒及其制備方法。本專利技術的方法及試劑盒測定簡便，靈敏度高，特異性強，穩定性好，為ST2檢測的一種方便實用的檢測方法。
技術介紹
ST2是1989年由Tominaga等作為白介素-1受體家族的新成員被發現，參與多種病理生理過程，具有免疫調節功能，尤其在各種炎癥性和變態反應疾病中發揮重要作用。由于當時未發現功能性配體，2005年以前一直認為是孤兒受體，2005年，Schmitz等發現IL-33作為ST2的特異性功能配體，實際ST2是一種心肌蛋白，分泌后會阻斷IL-33的作用，IL-33具有抗心肌肥大和抗心肌纖維化的作用。ST2表達于肥大細胞、激活的輔助性T細胞2、巨噬細胞和心肌細胞。ST2在心肌受到過度牽拉造成損失的過程中會大量產生，生成的ST2阻斷IL-33的作用，使心肌缺乏足夠的IL-33的保護，從而加速心肌重構和心室功能障礙，最終導致死亡風險增加。ST2包括4種亞型：sST2、ST2L、ST2V、ST2LV。其中，sST2為分泌型ST2，可分泌到細胞外，為IL-33的誘騙受體，抑制其信號傳導。在PRIDE研究中,208名急性心衰患者sST2水平顯著增高,回顧分析1年后死亡患者血清sST2水平明顯高于生存者, sST2與心衰患者的一年后的死亡風險呈劑量依賴的關系,多因素分析sST2預測一年的死亡率價值高。Weinberg進一步研究探討了非缺血性心衰患者(NYHAⅢ一Ⅳ級;EF<30%)發現,sST2是心衰兩周后心臟移植和死亡的獨立預測因子。總之,血清sST2水平升高伴有病死率的升高,是心力衰竭預后差的標志。ST2作為一種新型心衰標志物，目前僅有日本SML公司有一個科研使用的ELISA方法檢測試劑盒，并未有成型的商品化的檢測試劑應用于臨床并獲得相關藥監部門批準。膠乳免疫比濁法作為近年來發展迅速的生化檢測方法，由于其操作簡便，耗時較短，靈敏度大幅度提高而受到各種項目檢測的青睞。采用競爭膠乳比濁法檢測ST2作為一種先進的診斷方法對于臨床應用有巨大的作用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種簡便、準確、快速的ST2定量檢測方法。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中樣本先與ST2抗體結合，與ST2免疫原偶聯的膠乳微球形成競爭結合的關系，隨著樣本中ST2濃度的增加，引起膠乳凝集度降低。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中，ST2抗原首先同膠乳微球偶聯形成致敏微球，ST2偶聯的膠乳微球與抗體可形成本底的凝集反應；測定時，樣本中的ST2先與抗體反應形成復合物，從而競爭ST2歐聯的膠乳微球與抗體的反應，可造成凝集反應的減少，凝集度可通過全自動生化分析儀檢測，并以數字的形式表示為吸光度變化A，可通過凝集度的變化推算樣本中ST2含量。本專利技術的另一個目的在于提供一個檢測ST2的定量檢測試劑盒。該試劑盒簡便、靈敏度高、重復性好、具有很好的臨床應用前景。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中該試劑盒包含試劑1，試劑2，其特征在于樣本來源于任何包含水的液態物質，優選地，樣本為尿液或血液。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中試劑1為包含緩沖液、ST2抗體、促凝劑和防腐劑的混合物。緩沖液為PH7.0-8.0的50mMTRIS緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖液；ST2抗體為ST2免疫獲得的高靈敏度的兔多克隆抗體或單克隆抗體，含量為10-100ug/ml；促凝劑為含量為0.05%-3%的聚乙二醇6000。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中試劑2為包含緩沖液、ST2偶聯的膠乳微球、穩定劑和防腐劑的混合物。緩沖液為PH7.0-8.0的50mMTRIS緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖液；穩定劑為含量為0.1%-1%的牛血清白蛋白。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中ST2偶聯的膠乳微球，選擇的微球為表面含有羧基的聚苯乙烯微球，粒徑為110nm-200nm；通過碳化二亞胺活化后，加入10-100ug/ml的ST2混合反應3h形成可與ST2抗體形成凝集反應的致敏微球。根據這一專利技術目的的一個優選實施方案，其中該試劑盒測定前需使用校準品進行標定，該試劑盒選用的校準品為添加了ST2純品的人血清或其它類似血清基質的液體。優選地，選擇添加了ST2純品的牛血清白蛋白基質的液體。附圖說明圖1 ST2試劑盒（實施例1）標準曲線；圖2 ST2試劑盒線性范圍測定曲線。具體實施方式實施實例一：ST2偶聯的膠乳微球的制備根據本專利技術目的，首先制備ST2偶聯的膠乳微球，制備方法如下：a.將以下幾種組分混合對微球進行活化：1%的150nm羧基聚苯乙烯微球，50mMMES緩沖液，5mM碳化二亞胺,2mM NHS混合均勻，震蕩活化30min；b.10000rpm離心20min，除去活化劑；c.50mM磷酸緩沖重懸，并加入100ug/ml ST2蛋白，均勻混合3h；d. 10000rpm離心20min，除去未結合的蛋白；e.按照終濃度0.1%的致敏顆粒含量加入PH7.4含0.1%牛血清白蛋白的50mM磷酸緩沖液作為穩定劑制備成試劑2。實施實例二：試劑盒組成本試劑盒包含以下幾部分：表1：試劑組成成分實施實例三：測量程序確定校準品選擇含1%BSA的PBS緩沖液稀釋ST2蛋白，將濃度稀釋為0.125、0.25、1、2、4共5種濃度梯度使用全自動生化分析儀，選擇600nm波長進行檢測，按照試劑1：試劑2：樣本=180:60:25ul的參數進行檢測，檢測時，先加入試劑1和樣本混合5分鐘后，加入試劑2混勻30秒后，讀取吸光度1,4.5分鐘后讀取吸光度2，以這兩點的差值為判斷標準作標準曲線，見圖1。最終根據該標準曲線推算樣本中ST2含量。實施實例四：試劑盒分析性能測定試劑盒線性檢測：另取高于線性范圍的ST2蛋白樣本和低值樣本按照不同比例混合測定，最終使用測定值與理論值進行曲線擬合，擬合后線性相關系數大于0.99，則說明線性較好，具體數據見圖2。試劑盒重復性檢測：臨床收集10個樣本，用該試劑盒重復檢測20次，求出均值，并算出變異系數。變異系數小于15%時，則說明試劑盒具有較好的重復性。表2：試劑盒重復性檢測血清均值（ng/mL）變異系數樣品10.0325.71%樣品20.0574.93%樣品30.1823.21%樣品40.0915.16%樣品50.2943.42%樣品60.6312.79%樣品70.1933.87%樣品80.2183.91%樣品90.0835.38%樣品100.3274.8%本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種ST2定量檢測方法，樣本先與ST2抗體結合，與ST2免疫原偶聯的膠乳微球形成競爭結合的關系，隨著樣本中ST2濃度的增加，引起膠乳凝集度降低。

【技術特征摘要】
1.一種ST2定量檢測方法，樣本先與ST2抗體結合，與ST2免疫原偶聯的膠乳微球形成競爭結合的關系，隨著樣本中ST2濃度的增加，引起膠乳凝集度降低。2.根據權利要求1所述的ST2定量檢測方法，其特征在于ST2偶聯的膠乳微球與抗體可形成本底的凝集反應，凝集度可通過全自動生化分析儀檢測。3.根據權利要求1所述的ST2定量檢測方法，其特征在于使用時樣本中ST2先與抗體反應形成復合物，從而競爭ST2歐聯的膠乳微球與抗體的反應，可造成凝集反應的減少，可通過凝集度的變化推算樣本中ST2含量。4.一種ST2定量檢測試劑盒，包含試劑1，試劑2。5.根據權利要求4所述的ST2定量檢測試劑盒，其特征在于試劑1為包含緩沖液、ST2抗體、促凝劑和防腐劑的混合物。6.根據權利要求5所述的ST2定量檢測試劑盒試劑1，其特征在于緩沖液為提供抗原抗體反應最適條件的緩沖液，可以為TRIS緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖液；優選地，PH7.0-8.0的50mM磷酸緩沖液。7.根據權利要求5所述的ST2定量檢測試劑盒試劑1，其特征在于ST2抗體為ST2免疫獲得的高靈敏度的兔多克隆抗體或單克隆抗體，含量為10-100ug/ml，其含量低于可結合的ST2含量。8.根據權利要求5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周建平，
申請(專利權)人：北京德奧平生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11