本發明專利技術公開了一種柑桔枝干流膠病的分離鑒定方法，包括：選取采集的柑桔枝干，將枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無流膠病交界處；將莖段放入選擇性培養基中，在10℃光照培養箱中培養4?5天，挑取白色菌絲進行純化、保存。本發明專利技術提供了一種柑桔流膠病的病原菌的分離、培養和鑒定方法，實現了柑桔流膠病的病原菌的體外分離和培養，并能實現柑桔流膠病的病原菌鑒定。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物病原菌分離
，尤其涉及一種柑桔流膠病的分離鑒定方法。
技術介紹
柑桔流膠病主要發生在主干上，其次為主枝，小枝上也可發生。病斑不定型，病部皮層變褐色，水漬狀，并開裂和流膠。病樹果實小，提前轉黃，味酸。以高溫多雨的季節發病較重，菌核引起的流膠以冬季為重。果園長期積水、土壤黏重、樹冠郁閉有利其發生。現有的柑桔流膠病病原菌分離困難。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種柑桔流膠病的分離鑒定方法，旨在解決因柑橘流膠病病部濕度大，在病部極易附著大量的腐生菌，在進行一般組織分離時，由于其主要病原菌寄生疫霉的生長速度較慢，而雜菌生長速度較快，加上病原菌對營養成分的選擇性，使其極難分離出來的問題。本專利技術是這樣實現的，一種柑桔流膠病的分離鑒定方法，所述柑桔流膠病的分離鑒定方法包括以下步驟：步驟一，選取采集的柑桔枝干，將枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無流膠病交界處；步驟二，將莖段放入選擇性培養基中(燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合煮沸，分裝三角瓶中滅菌，冷卻至45℃，加氨芐青霉素，利福平，多菌靈)培養基利用，在10℃光照培養箱中培養4-5天，挑取白色菌絲進行純化、保存。進一步，所述步驟二之后對病原菌的電子顯微鏡檢測和病原菌的PCR鑒定。進一步，所述選擇性培養基的制備方法包括：燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合煮沸，分裝三角瓶中滅菌，冷卻至45℃，利用氨芐青霉素抑制細菌雜菌生長，加250mg，利用利福平防雜菌污染，加10mg，利用多菌靈防止霉菌污染，加100mg。進一步，所述病原菌的PCR鑒定方法包括：通過氯仿/異戊醇法抽提菌株的基因組DNA，用ITS1/ItTS4兩個通用引物進行PCR擴增，得到rDNA片段，產物經回收并測序，將所得到的序列登錄到網站進行BLAST比對，該菌株rDNA為寄生疫霉；另外一株菌為厚垣鐮刀菌，可參與侵染。本專利技術提供的柑桔流膠病的分離鑒定方法，可以最大程度上減小枝干流膠病部周邊腐生菌造成的分離困難；提供了一種柑桔流膠病的病原菌的分離、培養和鑒定方法，實現了柑桔流膠病的病原菌的體外分離和培養，并能實現柑桔流膠病的病原菌鑒定。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的柑桔流膠病的分離鑒定方法流程圖。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。下面結合附圖對本專利技術的應用原理作詳細的描述。如圖1所示，本專利技術實施例的柑桔流膠病的分離鑒定方法包括以下步驟：S101：選取采集到的柑桔枝干，將枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無流膠病交界處；S102：將莖段放入選擇性培養基中，在10℃光照培養箱中培養4-5天，挑取白色菌絲進行純化、保存；S103：病原菌的電子顯微鏡檢測和病原菌的PCR鑒定。所述選擇性培養基的制備方法包括：燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合煮沸，分裝三角瓶中滅菌，冷卻至45℃，利用氨芐青霉素抑制細菌雜菌生長，加250mg，利用利福平防雜菌污染，加10mg，利用多菌靈防止霉菌污染，加100mg。病原菌的PCR鑒定方法包括：通過氯仿/異戊醇法抽提菌株的基因組DNA，用ITS1/ItTS4兩個通用引物進行PCR擴增，得到rDNA片段，產物經回收并測序，將所得到的序列登錄到網站進行BLAST比對，該菌株rDNA ITS核苷酸序列比對結果為SEQ ID NO：1；TACACCATAAAACTTTCACGTGAACCGTTTCACCCAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGCGGCGGCTGCTGGCTTAATTGTTGGCGGCTGCTGCTGAGTGAGCCCTATCAAAAAAAAGGCGAACGTTTGGGCTTCGGCCTGATTTAGTAGTCTTTTTTTCTTTTAAACCCATTCCTTAATACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATTAAACTTGACTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGATGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGATTGGTCTTCGGACCGGCTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTAAACTGAACTTCTCTTTGCTCGAAAAGTGGTGGCGTTGCTGGTTGTGAAGGCTGCTATTGTGGCAAATTGGCGACTGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTAATGGAAGAGTGTTCGATTCGTGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAATGCACTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGACTGGTGAACCATAGCTCGGTGGCTTGGCTTTTGAATTGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGGGTGGCAGCTTCGGTTGTCGAGGGTCGATCCATTTGGGAACTTAATG
TGTACTTCGGTATGCATCTCAATTGGACCTGATATCACGCAAGATTACCCGCTGAACTTAAGCTAA經blast比對，為寄生疫霉另外一株菌的序列為SEQ ID NO：2GGGACGGGTCACTCCAACCCCTGTGACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAAAGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAAAACGCACCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCATTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCAAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCACCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCAAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA為厚垣鐮刀菌，可參與侵染，引起流膠病。菌絲塊接種離體冰糖橙葉片用1mL移液器吸頭將寄生疫霉菌固體培養基打孔，形成大小一致的菌絲塊，用牙簽將菌絲塊接種在展開的冰糖橙葉片或本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述柑桔流膠病的分離鑒定方法包括以下步驟：步驟一，選取采集的柑桔枝干，將枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無流膠病交界處；步驟二，將莖段放入選擇性培養基中，在10℃光照培養箱中培養4?5天，挑取白色菌絲進行純化、保存。
【技術特征摘要】
1.一種柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述柑桔流膠病的分離鑒定方法包括以下步驟：步驟一，選取采集的柑桔枝干，將枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無流膠病交界處；步驟二，將莖段放入選擇性培養基中，在10℃光照培養箱中培養4-5天，挑取白色菌絲進行純化、保存。2.如權利要求1所述的柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟二之后對病原菌的電子顯微鏡檢測和病原菌的PCR鑒定。3.如權利要求1所述的柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述選擇性培養基的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：姚廷山，胡軍華，肖田，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發明
國別省市：重慶;50
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