一種酶及其編碼基因和它們的應用以及制備人參皂苷化合物K的方法技術

本發明專利技術涉及生物領域，公開了一種酶及其編碼基因和它們的應用以及制備人參皂苷化合物K的方法。具體地，本發明專利技術提供了一種酶及其編碼基因，含有該基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，以及以該酶作為活性成分的組合物，及其在降解糖苷類化合物中的應用，并且提供了一種制備人參皂苷化合物K的方法。將本發明專利技術提供的酶用于降解三七葉總皂苷中的人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX時，其可能通過作用于人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX中C20位的木糖糖苷結構，同時也可將其C3位的葡萄糖水解下來，從而獲得人參皂苷CK，并且人參皂苷CK的轉化率在84％以上。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因工程領域，具體地，涉及一種酶及其編碼基因和它們的應用以及一種制備人參皂苷化合物K的方法。
技術介紹
人參皂苷化合物K(人參皂苷Compound K，人參皂苷CK，結構式如下式I所示)是二醇型人參皂苷(例如，人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX，結構式分別如下式II和III所示)在人體腸道內的主要代謝產物，屬于稀有人參皂苷。研究發現人參皂苷CK在體內外都有良好的抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，是一種潛在抗腫瘤藥物，并且在抗衰老、改善記憶、抗炎等各方面都有一定的療效。因此，如何獲得大量的人參皂苷CK是目前藥學研究的重點。目前，人參皂苷CK主要通過生物轉化法或生物合成法獲得。其中，生物轉化法是利用有機體(細胞、細胞器)或酶作為催化劑實現化學轉化的過程，是生物體系(包括細菌、真菌和植物組織等)對外源性底物進行結構修飾的化學反應。其本質是利用生物本身所產生的酶對外源底物進行的催化反應。生物轉化具有反應條件溫和、不易破壞皂苷結構、副產物少、后處理簡單及對環境友好等優點。近年來，以人參皂苷為原料進行生物轉化以獲得人參皂苷CK的研究越來越多，特別是利用微生物或酶對二醇型人參皂苷的C3和C20位的糖苷結構進行修飾，使含量較高的人參皂苷的糖苷經過水解作用，定向轉化為人參皂苷CK。根據構成糖苷結構的糖基的不同，人參皂苷中常見的糖苷結構包括葡萄糖苷、木糖苷、乳糖苷、阿拉伯糖苷等。但是，
現有的用于人參皂苷生物轉化的酶大部分具有高度專一性，即僅可以特異性作用于某一種糖苷結構，而無法滿足同時作用于一種以上糖苷結構的要求，從而導致轉化率較低。因此，急需研發可以同時作用于一種以上糖苷結構的酶，以提高生成人參皂苷CK的生物轉化率。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種新型的具有木糖苷酶和/或葡萄糖苷酶雙功能的酶及其編碼基因和它們的應用以及制備人參皂苷化合物K的方法。為了實現上述目的，第一方面，本專利技術提供了一種酶，其中，該酶為(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列組成的酶；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶活性不變的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。第二方面，本專利技術提供了編碼第一方面所述酶的基因。第三方面，本專利技術提供了含有第二方面所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。第四方面，本專利技術提供了一種組合物，其中，該組合物含有第一方面所述的酶作為活性成分。第五方面，本專利技術提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，以及第四方面所述的組合物中的任意一項在降解糖苷類化合物中的應用。第六方面，本專利技術提供了一種制備人參皂苷化合物K的方法，該方法包
括：在酶解條件下，將含有糖苷類化合物的原料與酶接觸，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由第四方面所述的組合物提供。通過上述技術方案，將本專利技術提供的酶用于降解人參皂苷Rb3、絞股藍皂苷IX和三七葉總皂苷時，其可能能夠作用于人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX中C20位的木糖糖苷結構，同時也可將其C3位的兩個葡萄糖水解下來，從而獲得人參皂苷CK，并且人參皂苷CK的轉化率在84％以上。本專利技術的其它特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本專利技術的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本專利技術，但并不構成對本專利技術的限制。在附圖中：圖1為本專利技術的實施例1獲得的重組質粒的雙酶切驗證結果，其中，1為DNA標記物，2-5為重組質粒；圖2為本專利技術的實施例1獲得的重組酶SDS-PAGE電泳圖，其中，M為蛋白標記物，1為粗酶液，2為純化的酶液；圖3為本專利技術的實施例1中酶活力測定的標準曲線圖；圖4為本專利技術的實施例2和3中經由實施例1獲得的酶液水解的人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX反應結果的TLC分析圖，其中，1為人參皂苷CK純品對照，2為人參皂苷Rb3純品對照，3為絞股藍皂苷IX純品對照，4為經實施例1獲得的酶液水解的人參皂苷Rb3，5為經實施例1獲得的酶液水解的絞股藍皂苷IX；圖5為本專利技術的實施例2中人參皂苷CK的HPLC色譜圖，其中，A為轉化前的結果，B為轉化后的結果；圖6為本專利技術的實施例3中人參皂苷CK的HPLC色譜圖，其中，A為
轉化前的結果，B為轉化后的結果；圖7為本專利技術的實施例4中人參皂苷CK的HPLC色譜圖，其中，A為轉化前的結果，B為轉化后的結果。具體實施方式以下對本專利技術的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應當理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值范圍，這些數值范圍應被視為在本文中具體公開。在本專利技術中，在未作相反說明的情況下，使用的術語“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力單位(U)表示，本專利技術中酶活力單位的定義是：在pH 4.5和45℃的條件下，以對硝基苯基-β-D-木糖苷為底物，每分鐘水解產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活力單位。第一方面，本專利技術提供了一種酶，其中，該酶為(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列組成的酶；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶活性不變的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。其中，酶活性不變是指在相同的測定條件下，由(a)衍生的蛋白質的底物轉化率與(a)的底物轉化率之間的百分比(相對活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。組成蛋白質的20種氨基酸殘基，按照側鏈極性可以分成四類：1、非極
性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、極性不帶電荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、帶正電荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)；4、帶負電荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見“生物化學”(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質中如果發生同屬一個類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質結構域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水囊袋結構的作用)沒有改變，因此對蛋白質的立體結構并不會產生影響，因此仍然可以實現蛋白的功能。所述同屬一個類別的氨基酸殘基取代可以發生在上述酶的任意一個氨基酸殘基位置上。如前所述，本專利技術提供的酶本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種酶，其特征在于，該酶為(a)或(b)：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的酶；(b)SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶活性不變的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。

【技術特征摘要】
1.一種酶，其特征在于，該酶為(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列組成的酶；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶活性不變的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。2.編碼權利要求1所述的酶的基因。3.根據權利要求2所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5.一種組合物，其特征在于，該組合物含有權利要求1所述的酶作為活性成分。6.權利要求1所述的酶、權利要求2或3所述的基因、權利要求4所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，以及權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓秀林，李銘剛，趙江源，黃開心，楊勝江，馬鳳靈，包崇卯，林婷婷，張孝龍，文孟良，艾黎，
申請(專利權)人：云南與諾生物工程有限責任公司，
類型：發明
國別省市：云南;53