吖啶標記結合物及其制備方法、化學發光試劑盒技術

本發明專利技術公開了一種吖啶標記結合物及其制備方法、化學發光試劑盒，吖啶標記結合物，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白；所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸；所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽。這種吖啶標記結合物的多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物反應形成化學鍵連接，待標記蛋白上的氨基與多聚氨基酸上的羧基反應形成?NH?CO?結構從而將多聚氨基酸和待標記蛋白連接到一起，結合位點相對確定，避免了吖啶取代物對待標記蛋白上的活性位點形成干擾，這種吖啶標記結合物的活性相對較高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及體外檢測領域，尤其涉及一種吖啶標記結合物及其制備方法、化學發光試劑盒。
技術介紹
化學發光標記免疫分析又稱化學發光免疫分析(CLIA)，是用化學發光劑直接標記抗原、半抗原或抗體的免疫分析方法。用于標記的化學發光物質包括吖啶取代物，根據取代基的不同，吖啶取代物分為兩類：吖啶酯(acridinium ester，AE)和吖啶磺酰胺，二者均為有效的發光標記物，通過起動發光試劑(NaOH、H2O2)作用而發光，強烈的直接發光在一秒鐘內完成，為快速的閃爍發光。吖啶取代物作為化學發光標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無須催化劑，檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低，與大分子的結合不會減小所產生的光量，從而增加靈敏度。這類化合物從發光的機理來說特點是：1、發光反應中在形成電子激發態中間體之前，聯結于吖啶環上的不發光的取代基部分從吖啶環上脫離開來，即未發光部分與發光部分分離，因而其發光效率基本不受取代基結構的影響。2、吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物化學發光不需要催化劑，在有H2O2的稀堿性溶液中即能發光。因此應用于化學發光檢測具有許多優越性，優點主要有：①背景發光低，信噪比高；②發光反應干擾因素少；③光釋放快速集中、發光效率高、發光強度大；④易于與蛋白質聯結且聯結后光子產率不減少；⑤標記物穩定(在2-8℃下可保存數月之久)。因此吖啶取代物是一類非常有效、非常好的化學發光標記物。吖啶標記結合物為吖啶取代物與待標記物(抗體、抗原，等)結合得到的復合物。吖啶標記結合物質量的好壞直接關系到化學發光免疫分析技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。目前常用的吖啶標記結合物的制備方法是碳二亞胺交聯法，以碳二亞胺交聯劑為橋，使吖啶取代物與待標記蛋白結合。然而，傳統方法制得的吖啶標記結合物中，吖啶取代物與待標記蛋白通過碳二亞胺結合，吖啶取代物往往會對待標記蛋白上的活性位點形成干擾，造成吖啶標記結合物的活性降低，影響免疫分析的靈敏度。
技術實現思路
基于此，有必要提供一種活性相對較高的吖啶標記結合物及其制備方法、化學發光試劑盒。一種吖啶標記結合物，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白；所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應形成化學鍵連接；所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將所述多聚氨基酸和所述待標記蛋白連接到一起。在一個實施例中，所述吖啶取代物為吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。在一個實施例中，所述多聚氨基酸為聚合度大于25的多聚賴氨酸。在一個實施例中，所述待標記蛋白為抗原、半抗原或抗體。一種上述的吖啶標記結合物的制備方法，包括如下步驟：用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯，充分反應后得到吖啶取代物-多聚氨基酸結合物，其中，所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應形成化學鍵連接；對所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物進行純化；用交聯劑對純化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物上的羧基進行活化；以及用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物與待標記蛋白交聯，充分反應后得到吖啶標記結合物，其中，所述吖啶標記結合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白，所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將所述多聚氨基酸和所述待標記蛋白連接到一起。在一個實施例中，所述用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯的操作中，所述活化后的吖啶取代物和所述多聚氨基酸的摩爾比為1～10000：1。在一個實施例中，所述用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物與待標記蛋白交聯的操作中，所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物與所述待標記蛋白的摩爾比為5：1～1：5。在一個實施例中，所述用交聯劑對純化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物上的羧基進行活化的操作中，所述交聯劑包括碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺。在一個實施例中，所述碳二亞胺選自二環己基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N,N'-二異丙基碳二亞胺中的至少一種，所述碳二亞胺與所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物的摩爾比為5～1000：1；所述羥基琥珀酰亞胺選自N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基磺基琥珀酰亞胺中的至少一種，所述碳二亞胺與所述羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為10：1～1：20。一種化學發光試劑盒，用于結合待標記蛋白形成如上述的吖啶標記結合物，所述化學發光試劑盒包括：吖啶取代物和多聚氨基酸；所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸可以通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應形成化學鍵連接；所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標記蛋白上的氨基可以與所述多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將所述多聚氨基酸和所述待標記蛋白連接到一起。這種吖啶標記結合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白，多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物反應形成化學鍵連接，待標記蛋白上的氨基與多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將多聚氨基酸和待標記蛋白連接到一起，結合位點相對確定，避免了吖啶取代物對待標記蛋白上的活性位點形成干擾，這種吖啶標記結合物的活性相對較高。此外，多聚氨基酸可使吖啶標記結合物的空間位阻增大，從而增加了吖啶標記結合物的使用靈敏度。附圖說明圖1為一實施方式的吖啶標記結合物的制備方法的流程圖；圖2為測試例2中得到的系列濃度TSH抗原樣本檢驗結果散點圖。具體實施方式為使本專利技術的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實施例對本專利技術的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本專利技術。但是本專利技術能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本專利技術內涵的情況下做類似改進，因此本專利技術不受下面公開的具體實施的限制。一種吖啶標記結合物，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白。多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物反應形成化學鍵連接。本實施方式中，多聚氨基酸可以為聚合度大于25的多聚賴氨酸。優選的，多聚氨基酸為聚合度為100～200的多聚賴氨酸。待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待標記蛋白上的氨基與多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將多聚氨基酸和待標記蛋白連接到一起。待標記蛋白可以為本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以為通過修飾后引入氨基的改性蛋白或改性多肽。本實施方式中，待標記蛋白為抗原、半抗原或抗體。吖啶取代物可以為吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-吖啶甲酸)、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根據吖啶取代物的具體不同，多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物上的不同基團(羧基、琥珀酰亞胺酯等)反應形成化學鍵連接。具體的，吖啶酯可以為AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種吖啶標記結合物，其特征在于，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白；所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應形成化學鍵連接；所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應形成?NH?CO?結構從而將所述多聚氨基酸和所述待標記蛋白連接到一起。

【技術特征摘要】
1.一種吖啶標記結合物，其特征在于，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白；所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應形成化學鍵連接；所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將所述多聚氨基酸和所述待標記蛋白連接到一起。2.根據權利要求1所述的吖啶標記結合物，其特征在于，所述吖啶取代物為吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。3.根據權利要求1所述的吖啶標記結合物，其特征在于，所述多聚氨基酸為聚合度大于25的多聚賴氨酸。4.根據權利要求1或3所述的吖啶標記結合物，其特征在于，所述待標記蛋白為抗原、半抗原或抗體。5.一種權利要求1～4中任一項所述的吖啶標記結合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯，充分反應后得到吖啶取代物-多聚氨基酸結合物，其中，所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應形成化學鍵連接；對所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物進行純化；用交聯劑對純化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物上的羧基進行活化；以及用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結合物與待標記蛋白交聯，充分反應后得到吖啶標記結合物，其中，所述吖啶標記結合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標記蛋白，所述待標記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應形成-NH-CO-結構從而將所述多聚氨基酸和所述待標記蛋白連接到一...

【專利技術屬性】
技術研發人員：錢純亙，肖成勇，祝亮，劉陶旭，夏福臻，
申請(專利權)人：深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44