本發明專利技術的核酸適配體(DNA?aptamer)是單鏈寡聚脫氧核糖核苷酸(Oligodeoxynucleotide)，具有不同的脫氧核糖核苷酸(Deoxynucleotide)序列，它們在溶液中對除草劑滅草松(Bentazon)具有識別能力，可作為生物識別材料用于開發檢測樣品中滅草松的含量。這些核酸適配體序列是通過從隨機核酸庫(Random?DNA?pool)中進行體外篩選(In?vitro?Selection或SELEX)獲得。在水溶液中，本發明專利技術的核酸適配體序列對滅草松分子的結合強度達到微摩爾每升(μM)量級的離解常數(Kd)。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物識別材料領域，所開發的核酸適配體序列是性能優越的生物識別分子，可識別滅草松分子及其衍生物。這些核酸適配體序列可以作為生物識別材料來開發檢測各種樣品(包括環境樣品、食品樣品等)中滅草松的試劑、技術及儀器。技術背景目前中國農業用化工產品存在嚴重的環境污染問題，例如大量無序地除草劑使用后，其通過暴雨徑流進入和江、湖泊、水庫等地表水體，引發嚴重的地表水的污染，威脅水生生態系統安全及生活飲用水的安全。滅草松是一種較為常用的除草劑[1-2]，在中國實用范圍廣、用量大。為了應對除草劑污染問題，對環境水樣中除草劑的檢測監控十分重要，可用于污染預警以及作為針對性污染物處理的指導依據。中國《生活飲用水衛生標準》(GB5749-2006)中將滅草松列為污染物之一，其限制濃度在環境水樣中不可高于1ppm[3]。常見的環境污染物檢測方法通常使用大型儀器，例如高效液相色譜或質譜聯用等技術[4]。這些大型儀器檢測雖然非常準確，但是只能在固定的實驗室里使用，因而需要從取樣點將樣品送至實驗室進行檢測，時間長，而且需要專業的技術人員操作。近年來，可現場快速對污染物進行檢測或初篩的技術需求越來越迫切[5]，這些方法通常使用便攜式儀器和識別目標污染物的生物識別材料來實現。在生物識別材料方面，通常使用抗體、核酸適配體等材料來在樣品中特異性識別目標污染物，從而使得檢測過程避免復雜的樣品預處理，便于操作，且可達到較高的檢測靈敏度，同時對環境背景干擾物有較強的選擇性。抗體通常通過生物免疫技術從動物體內獲得[6]，核酸適配體通常通過生物體外篩選技術從隨機核酸庫中得到[7]。盡管對于一些環境污染物都已有成熟的抗體或核酸適配體可用，但是目前無論是商品化產品或科學研究中，都沒有針對滅草松的抗體或適配體等生物識別材料可用。開發識別滅草松的生物識別材料，是開發現場快速檢測滅草松的試劑盒和技術的重要基礎。
技術實現思路
利用體外篩選技術，本專利技術獲得了針對滅草松及其衍生物的核酸適配體生物識別材料，包括一系列的脫氧核糖核酸序列，這些序列對滅草松的結合能力達到了微摩爾每升(μM)量級的離解常數(Kd)。專利技術的優點和積極效果1、本專利技術的核酸適配體序列，是目前國際上第一次獲得的可識別滅草松的核酸適配體。至今在專利、科學研究論文、商業產品中都沒有任何針對滅草松的抗體或核酸適配體報道或使用。2、使用本專利技術的核酸適配體序列作為生物識別材料，將可開發現場快速檢測滅草松的試劑盒和監測技術及儀器，具有廣泛的環境檢測應用前景，也可進一步拓展用于食品安全的快速檢測。具體實施方式1、核酸隨機庫合成(1)合成步驟：取出固相合成柱(儲存無水即可，一般儲存在-20℃冷凍室內，取出恢復室溫才可用)；打開電腦、固相合成儀、氣泵(打開高純氬，擰松分壓閥，調節閥門使壓力表達到指定范圍)；打開軟件MM；提前建立文本文檔編輯合成隨機庫的序列，格式：名稱+半角逗號+序列(順序為5’端到3’端)；檢查已有方法，確保堿基為對應通道，檢查管路液體流出是否正常；設置隨機庫合成程序，開啟反應；待反應結束后取出固相合成柱，關閉儀器、高純氬氣。(2)反應步驟：去封閉(Deblocking)：用三氯乙酸(TCA)去除CPG所連核苷上的DMT,以暴露5’羥基，供下一步縮合。此步需要注意TCA為較強的酸，可能會有脫嘌呤作用,故TCA與寡核苷酸接觸時間不能超過規定時間。活化(Activation)：在縮合之前，單體與四唑混合并進入合成柱，此時四唑提供一個質 子給3’磷酸上二異丙胺基的N原子，質子化的二異丙胺是一個良好的游離基團，與四唑形成亞磷酰胺四唑這種活性中間體。此步四唑過量保證了單體活化充分。連接(Coupling)：亞磷酰胺四唑與CPG所連的核苷酸碰撞時，與其5’羥基發生親核反應，發生縮合并脫掉四唑，合成的寡核苷酸鏈延長一個。此步單體相對于CPG所連核苷酸上5’-羥基過量保證了高效率連接。蓋帽(Capping)：為了防止未反應的與CPG相連的5’羥基在隨后的循環中被延長，需要在連接反應充分進行之后使之封閉，常用乙酰化來封閉此羥基。臨用前混合乙酸酐和N-甲基咪唑等形成活性很強的乙酰化試劑，與少量未參與連接反應的5’羥基縮合成酯鍵。由于須封閉的羥基少且乙酰化試劑活性高和充分過量，此步反應速度很快，幾秒鐘即足夠。太長的蓋帽時間有在非預期位置發生乙酰化反應的可能，且增加乙酸酐與痕量水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。氧化(Oxidation)：連接反應后新加上的核苷酸通過亞磷酯鍵(磷為三價)與CPG上相連的寡核苷酸鏈連接，此亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿水解，因此需將此處三價磷氧化為五價的磷，常用的氧化劑為碘的四氫呋喃溶液。此步反應速度亦很快。應注意最后一個循環時，氧化步驟不可省略。此外亦可用其他氧化劑來完成氧化，從而得到各種符合實驗需要的寡核苷酸。循環上述一至五步，寡核苷酸鏈即可延伸至所需長度時即可完成。(3)合成后處理：切割：將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG上連接化合物與初始核苷間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。將合成柱中的固相載體取出至1.5mL的離心管中，加入1mL濃氨水70℃加熱2.5小時。純化：根據所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方法。常用的純化方法有：C18柱、OPC柱、PAGE和HPLC。本專利選用HPLC純化方法，將HPLC的柱子選為C18用于DNA純化。脫保護基：須在此步前選好后續的純化方法。一般用新鮮的濃氨水處理較長時間以脫掉腈乙基、苯甲酰基、異丙基，用三氟乙酸脫5’-DMT.加入3％體積的三氟乙酸(濃縮后的DNA為1體積)，振蕩反應45秒左右，迅速加入2體積的10×TBE緩沖溶液進行中和；將DNA過Amicon清洗濃縮，12500rpm，離心12分鐘，共離心6次，最后一次30分鐘左右。(4)定量：根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。(5)儲存：通常一次合成提供的寡核苷酸的量會比所需要的量大得多，所以會涉及到寡核甘酸的儲存問題。一般來說，由于寡核甘酸的穩定性很好，但需要注意的是避免紫外線等劇烈的物理環境，避免反復凍融，-20℃可穩定保存一年以上。2、核酸適配體的篩選(1)緩沖溶液清單偶合緩沖液：50mM磷酸鈉溶液，pH為7.2，0.15M NaCl；清洗緩沖液：50mM Tris-HCl，pH為7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA；篩選緩沖液：50mM Tris-HCl，pH為7.3，0.4M NaCl；單鏈緩沖液：110mM Tris-HCl，pH為7.3，0.86M NaCl；磷酸鹽緩沖液：10mM磷酸溶液，100mM NaCl，pH為7.4～8.0；熒光測量緩沖液：0.5M磷酸鈉溶液，pH為8.0；10×TBE緩沖液：890mM Tris-硼酸，20mM EDTA。(2)滅草松分子固定制備接有滅草松的瓊脂(圖1)a.MB-COOH綴合反應(COOH-NH2)試劑：瓊脂糖(NHS活化)含有氨基分子(20mM,溶液中不含COOH，本實驗中使用含有氨基、疊氮的小分子)偶合緩沖液(50mM磷酸鈉pH 7.2,0.15M NaCl)清洗緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7.4,0.15M NaCl,1m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
本專利技術中的脫氧核糖核酸適配體(DNA?aptamer)序列，包括在圖4中的5種序列，用于識別或檢測滅草松(Bentazon)及其衍生物。
【技術特征摘要】
1.本發明中的脫氧核糖核酸適配體(DNA aptamer)序列，包括在圖4中的5種序列，用于識別或檢測滅草松(Bentazon)及其衍生物。2.在上述權利要求1中的5種序列的突變體(Mutant)，用于識別或檢測滅草松及其衍生物。所指的突變體的序列和上述1中的序列差異在0～50％數量以內的脫氧核糖核苷酸(即突變核苷酸數目在0～20之間)，每個突變核苷酸的堿基可以是胸腺嘧啶(Thymine)、胞嘧啶(Cytosine)、鳥嘌呤(Guanine)、腺嘌呤(Adenine)四種中的任意一種。3.在上述權利要求1和2中的各種核酸的衍生物，用于識別或檢測滅草松及其衍生物。所指的衍生物包括其中的一個或多個脫...
【專利技術屬性】
技術研發人員：向宇，何苗，
申請(專利權)人：清華大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
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