本發明專利技術屬于分子生物學與生物醫學技術領域，具體的說，本發明專利技術涉及基于CRISPR/Cas9靶向敲除兔骨形態發生蛋白2(BMP2)基因的細胞模型及其應用。本發明專利技術根據CRISPR/Cas9的設計原則，在兔BMP2基因上3個靶向位點，合成相應的oligos，并且將其構建在px458載體上。在兔骨髓間充質干細胞中利用針對這3個靶點構建出的CRISPR/Cas9系統，可以有效的敲除兔BMP2基因，這一系統易于操作，兔BMP2基因敲除效率高。本發明專利技術公開的兔BMP2基因敲除細胞模型能極大地促進BMP2基因功能及信號通路的相關研究。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學與生物醫學
，具體涉及基于CRISPR/Cas9靶向敲除兔骨形態發生蛋白2(BMP2)基因的細胞模型及其應用。
技術介紹
CRISPR/Cas系統是從細菌和古生菌對抗外來病毒或質粒的適應性免疫系統發展而來，包括三種不同的類型，其中TypeII型的CRISPR/Cas系統的DNA內切酶Cas9只有一個亞基，結構最為簡單，所以應用也最廣泛。除了Cas9蛋白外，該系統還包括兩條短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activatingcrRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA復合體可以通過堿基互補配對指導Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospaceradjacentmotif)附近特異性剪切DNA雙鏈，形成DSB(doublestrandbreak)。DSB可以通過兩種途徑被修復，一種是非同源重組的末端接合(Non-HomologousEndJoiningNHEJ)DNA修復方式，另一種是同源重組修復(HomologyDirectedRepairHDR)方式。NHEJ修復方式可能產生堿基的插入或缺失，從而產生移碼突變，或者也可能突變成終止密碼子，這些突變形式都可以改變目的基因的開放閱讀框；HDR方式需要一段與被剪切片段同源的模板片段來修復DSB，這種修復方式可以將被用來作為模板的同源片段的序列復制到目的基因中，所以可以利用這種修復方式將特定的基因片段引入到目的基因中。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)又名成骨蛋白(osteogenicproteins，OPs)，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，1965年首次被發現并因其具有誘導骨形成的能力而得名。目前已知的BMPs數量已達30余種。成熟的BMPs是30-38kDa的蛋白，其作用通過BMPs受體與Smad蛋白磷酸化等信號傳導途徑而完成。BMPs可調節細胞增殖，分化及凋亡，尤其在胚胎機體發育過程中對組織器官形態發生，在成年機體生長過程中對組織器官形態的維持起重要作用。BMP最初是作為能夠在體內誘導骨和軟骨的形成的因子為人們所認識的，對骨骼的胚胎發育和再生修復起重要作用。現在研究認為，它們參與調節許多種細胞的增殖、分化和凋亡的生物學過程。骨形態發生蛋白2(BMP-2)隸屬于骨形態發生蛋白家族。BMP2被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子。BMP2作為TGF-β超家族成員之一，它的主要功能是參與調控多種基因的生理活性，除了能引起多種細胞的增值、分化和凋亡外，還參與組織的再生和修復，BMP2作為最主要的骨形成調控因子，參與正常骨代謝中的各個階段。它能夠增加造血細胞的數量，提高骨髓單個核細胞中CD34下撥的數量比例，從而加快骨髓造血系統的重建，BMP2還可能參與面神經損傷后早期應激反應級修復再生活動。近年來的研究發現BMP-2不僅能誘導成骨，而且還可以促進或抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移。目前，BMP-2對惡性腫瘤細胞的增殖和轉移的作用尚存在爭議，可能與BMP-2的活性梯度和濃度，以及細胞內、外抑制劑有關。但是，作為當前腫瘤研究中的一個熱點，通過對BMP-2的相關研究，將幫助了解BMP與惡性腫瘤發生和轉移的關系，為今后的臨床治療腫瘤提供一個新的途徑。目前，關于BMP-2的成骨機制已經較明確，其及其受體與相應的TGF-β配體和受體的密切關系使其與腫瘤發生及發展的關系越來越引起關注，但是其在腫瘤中的作用機制還沒有完全明確。腫瘤的發生是一個多基因參與的、多因素介導的過程，BMP-2及其通路中的因子在腫瘤發生及發展中也是與別的因子或基因協同發揮作用的，該通路或許發揮著重要的作用，隨著研究的進展，可以為臨床治療提供一個新的靶點。因此，利用CRISPR/Cas9系統開發出一種BMP2基因敲除細胞模型，對促進BMP2基因功能及信號通路的相關研究，尤其是在骨骼再生修復和腫瘤治療的靶標的研究就用極其重要的作用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于將骨形態發生蛋白2(BMP-2)基因敲除的CRISPR/Cas9系統，及其質粒載體，以及所得到的細胞模型。本專利技術應用CRISPR/Cas9技術敲除兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)BMP2基因，采用脂質體轉染方法，實現了建立BMP2基因敲除的細胞模型。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是目前骨組織工程中應用最廣泛的種子細胞，具有取材方便、對機體損傷少、與生物支架材料的粘附性能好、在體外培養具有較強的增值傳代能力等優點。本專利技術公開的CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的細胞模型，所述CRISPR/Cas9用于特異性靶向人TCAB1基因的gRNA在兔BMP2基因上的靶序列符合5’-N(20)-NGG3’或者5’-CCN-N(20)-3’的序列排列規則，兔BMP2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在兔BMP2基因的靶向位點位于兔BMP2基因的外顯子上。上述CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的細胞模型，其特征在于：所述靶向位點如序列表SEQ ID NO.2序列所示。上述CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的細胞模型，其特征在于：該細胞模型在制備抑制腫瘤的試劑中的應用。上述CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的細胞模型，其特征在于：該細胞模型在制備促進骨骼生長的試劑中的應用。本專利技術建立的BMP2基因敲除細胞模型，對于研究BMP2基因在成骨機制已經較明確，其及其受體與相應的TGF-β配體和受體的密切關系使其與腫瘤發生及發展的關系提供了有力的工具，該細胞模型能極大地促進BMP2基因功能及信號通路的相關研究，尤其是在骨骼再生修復和腫瘤治療的靶標的研究就用極其重要的作用。該細胞模型制備方法簡單，成本低廉，具有良好的穩定性和可靠性。附圖說明附圖1為T7Endonuclease I酶切結果(其中1-3泳道為不同靶向位點PCR效果；4-6泳道為不同靶向位點酶切效果)；附圖2為測序結果圖。具體實施方式下面將結合附圖，對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1靶向兔BMP2基因的gRNA合成及載體構建1、靶向兔BMP2基因的gRNA的選擇和設計在Genebank中找到兔BMP2基因的序列，在兔BMP2基因的第1外顯子區域設計潛在靶位點。通過在線設計工具(http://crispr.mit.edu/)及gRNA的設計原則，評估兔BMP2基因序列上得分較高的靶位點設計gRNA，靶位點序列為SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3，并設計對應的寡核苷酸。2、靶向兔BMP2基因的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表達載體的構建將pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)質粒(AddgeneplasmidID：48138，以下簡稱pSpCas9(BB))，用BbSI酶切，37℃水浴1小時后，1％的瓊脂糖電泳，回收酶切產物(TAKARA膠回收試劑盒)。酶切體本文檔來自技高網...
【技術保護點】
CRISPR?Cas9靶向敲除兔BMP2基因的細胞模型，所述CRISPR?Cas9用于特異性靶向人TCAB1基因的gRNA在兔BMP2基因上的靶序列符合5’?N(20)?NGG3’或者5’?CCN?N(20)?3’的序列排列規則，兔BMP2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在兔BMP2基因的靶向位點位于兔BMP2基因的外顯子上。
【技術特征摘要】
1.CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的細胞模型，所述CRISPR-Cas9用于特異性靶向人TCAB1基因的gRNA在兔BMP2基因上的靶序列符合5’-N(20)-NGG3’或者5’-CCN-N(20)-3’的序列排列規則，兔BMP2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在兔BMP2基因的靶向位...
【專利技術屬性】
技術研發人員：申友亮，朱同娥，張靖靖，李修敏，
申請(專利權)人：青島市膠州中心醫院，
類型：發明
國別省市：山東;37
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