一種用于檢測(cè)眼科疾病的試劑盒及其檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種包含特異結(jié)合人瘦素蛋白leptin的核酸適體的試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)提供的核酸適體，與人瘦素蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明專利技術(shù)的核酸適體，可以捕獲溶液中的人瘦素蛋白，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將用于眼病的篩查。利用本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種用于檢測(cè)眼科疾病的試劑盒及其檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
格雷夫斯病(Graves'disease)是一種常見(jiàn)病，女性發(fā)病率為1/1000人/年。除甲狀腺功能亢進(jìn)以外，25-50％患有格雷夫斯病的個(gè)體病情發(fā)展到在臨床上累及眼睛，即甲狀腺眼病。格雷夫斯眼病(Graves'Ophthalmopathy,GO或TAO)是甲狀腺眼病的典型形式。雖然一些GO患者只患有輕微的眼睛不適，但是3-5％患有劇烈疼痛和炎癥伴有復(fù)視乃至視力喪失。目前由于本病原因未明，臨床主要以激素、免疫抑制劑、生長(zhǎng)激素類似物、抗甲狀腺藥物、眶內(nèi)放射、眼眶減壓術(shù)等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今為止尚無(wú)任何一種藥物能有效治療TAO，并獲長(zhǎng)期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關(guān)眼病的藥物是亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。而檢測(cè)所述疾病更是本領(lǐng)域積極研究的方向。近年來(lái)的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)對(duì)TAO患者眼眶前脂肪成纖維細(xì)胞增殖、移行以及細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)形成具有重要的作用。因此，檢測(cè)人瘦素蛋白的表達(dá)情況，可以直接用于鑒定甲狀腺相關(guān)眼病。然而傳統(tǒng)的檢測(cè)人瘦素蛋白的表達(dá)情況具有操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematlc Evolutlon of Llgands by Exponentlal enrlchment,SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫(kù)中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識(shí)別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識(shí)別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無(wú)免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動(dòng)力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會(huì)存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測(cè)、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種特異結(jié)合leptin的核酸適體及其試劑盒。本專利技術(shù)提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。所述核酸適體與leptin蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。所述核酸適體可用于制備檢測(cè)leptin的試劑盒。利用本專利技術(shù)的核酸適體，可以捕獲血液中的leptin，從而用于甲狀腺相關(guān)眼病篩查。利用本專利技術(shù)的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲leptin進(jìn)行檢測(cè)，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)具有很高的應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本專利技術(shù)，但并不限定本專利技術(shù)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、核酸適體的篩選和制備設(shè)計(jì)兩端包含大約20個(gè)核苷酸、中間包括39個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫(kù)如下：5’-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’；N39代表39個(gè)隨機(jī)核苷酸。將單鏈DNA文庫(kù)擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫(kù)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μg RNA文庫(kù)經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ug leptin蛋白(利用CN100366738C公開(kāi)的方法，表達(dá)得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無(wú)水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫(kù)用于下一輪篩選；每輪篩選過(guò)程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫(kù)，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫(kù)，篩選共進(jìn)行12輪。得到了15個(gè)適配子，其序列分別為SEQ ID NO:1-15所示。具體序列如下所示：leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:1)leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:2)leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:3)leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:4)leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:5)leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:6)leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:7)leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:8)leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:9)leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:10)leptin-11：TAGAC本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于眼科疾病檢測(cè)的試劑盒，其含有核酸適體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于眼科疾病檢測(cè)的試劑盒，其含有核酸適體。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸適體為SEQ ID No：5所述。3...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李倩，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：李倩，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：江蘇;32