本發明專利技術涉及微生物技術領域，具體公開了一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）YTK1及其在煙葉烘烤中的應用。所述菌株于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），菌種保藏號為GDMCC?No：60033。本發明專利技術發現菌株YTK1環境適應性強、能夠耐受高溫生長且長勢好、同時能夠高效降解煙葉淀粉含量及改善煙葉色香味，經所述菌株處理過的烘烤煙葉能夠充分降解淀粉，可用于制備煙葉改良噴施菌劑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物
，具體地，涉及一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTK1及其在煙葉烘烤中的應用。
技術介紹
煙草是葉用經濟作物，其生產效益高低主要取決于煙葉質量的優劣。近年來隨著新品種選育、集約化培育、平衡施肥等生產新技術的推廣應用，我國烤煙煙葉量水平有所提高，但與國外優質煙葉還是有一定的差距。淀粉是煙葉中重要的基礎有機化合物，在鮮煙葉中一般含有25～40％左右，烘烤過程中發生顯著的變化，碳水化合物的降解、轉化、消耗和積累狀況決定著煙葉內在品質和外觀商品等級的優劣。煙葉分解產物中，來自淀粉降解產物糖與氨基酸反應的占80％左右，而在煙氣中占85％左右。初烤后煙葉殘留的淀粉是對煙葉色、香、味不利的化合物，嚴重影響煙葉的外觀和內在質量。在C/N平衡的條件下，煙葉中淀粉含量越低越好，可溶性糖和還原糖在抽吸時裂解物產生的酸性產物對平衡由煙堿和含氮化合物抽吸過程中產生的堿性煙氣有積極作用。因此對淀粉代謝的研究已引起了廣泛的關注，同時由于目前國內初烤煙葉淀粉含量較高，所以近幾年對淀粉降解研究也正成為一個熱點。芽孢桿菌是土壤和自然界的優勢微生物種群，廣泛存在于自然界中，大多為非致病性細菌，對人畜無害，并且很多種類都具有抑制植物病害生長的能力。芽胞桿菌大多為內生芽胞，繁殖速度快，抗逆能力強，易定殖在植物根際表面。密集烤房實行機械設備通風，由于葉間隙風速大、強制排濕進而影響煙層溫濕度、風速的分布，造成煙葉失水方式變化，烤后煙葉普遍存在顏色偏淡、成熟度下降、香氣減弱，究其原因煙葉淀粉降解不充分，糖轉化不完全所致。微生物的自養異養需要碳源和氮源，煙葉中就含有微生物生長繁殖的碳源和氮源，十分適于進行微生物發酵培養，而其自養異養所產生的生理生化作用對煙葉品質造成一定影響。芽孢桿菌能夠在逆境中存活和生長，在較低水分高溫條件下的烘烤煙葉中能夠充分的利用淀粉以及高效產淀粉酶，從而降低煙草淀粉含量，所以篩選耐高溫高效降解淀粉功能微生物在煙草應用上具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術針對上述現有技術的不足，提供了一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YTK1，所述菌株YTK1能夠附著于煙葉表面，進入煙葉組織，與煙葉葉肉組織共生，在較低濕度條件下利用煙葉淀粉作為自身代謝的能源，以及高效產淀粉酶，充分降解了煙葉淀粉含量，從而改善煙葉品質。本專利技術的另一目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌YTK1在煙葉烘烤中的應用。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案予以實現的。一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YTK1，所述菌株YTK1于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），菌種保藏號為GDMCC No：60033，所述菌株分類命名為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YTK1；保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5層。所述菌株YTK1的分離與篩選步驟如下：（1）分離：將采集的新鮮煙葉剪碎，置于滅菌培養皿中，經雙氧水浸泡、升汞浸泡、無菌水漂洗后，置于LB液體培養基中37 ℃，120 r/min擴大培養2 d，經80 ℃水浴30 min殺死非芽孢桿菌，取上述菌液置于LB固體培養基上37 ℃培養2 d，挑取長勢較好的菌落進行傳代培養，再通過簡單染色（石碳酸復紅染色）和顯微鏡鏡檢（油鏡）觀察，將純化菌株接種于LB液體培養基培養2～3 d，80 ℃水浴30 min后于LB固體培養基上涂平板獲得芽孢桿菌；（2）篩選：將步驟（1）得到的芽孢桿菌接種于LB固體培養基上，在50～70 ℃范圍內每隔2 ℃作為一個處理，10個處理，重復3次，恒溫培養；刮取菌體，用無菌水稀釋成10-3菌體濃度，取2 μL菌液接種于淀粉瓊脂平板上37 ℃培養1～2 d，經即配碘液染色，觀察透明圈，獲得降解淀粉功能的芽孢桿菌。優選地，所述菌株YTK1呈桿狀，產芽孢，菌株YTK1菌落在LB培養基平板上生長速度較快，在液體培養基中形成菌膜，在固體培養基上菌落呈淡黃色，不透明，表面粗糙，邊緣不規則。優選地，所述菌株YTK1對濃度為1.5%NaCl、300 μg/mL氨芐青霉素、100 μg/mL鏈霉素和四環素、5 μg/mL氯霉素和紅霉素均具有耐受性；對卡拉霉素、慶大霉素和新霉素耐受性小于5 μg/mL。優選地，所述菌株YTK1能利用以淀粉、吐溫40、吐溫80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、蔗糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龍膽二糖、D-纖維二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、側金盞花醇、甲酸鈉、丙酸鈣、α-酮戊二酸、丙酮酸鈉、羥基苯乙酸、苯甲酸鈉、葡萄糖酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、水楊酸鈉、烏頭酸、蘋果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水楊苷、甘油、羥甲基纖維素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羥脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為碳源的培養基上生長優選地，所述菌株YTK1的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。本專利技術還提供上述的耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTK1在煙葉烘烤中的應用。優選地，所述應用的具體方法為將OD600=1的YTK1菌株的菌懸液噴施于烘烤前的煙葉表面。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：（1）本專利技術篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌YTK1生長速度快、對環境適應性強、抗逆性強。（2）本專利技術篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌YTK1，具有在煙葉高溫烘烤過程中高效降解淀粉的能力，經所述菌株處理過的烘烤煙葉能夠充分降解烘烤煙葉淀粉含量，一定程度上降低煙絲燃吸時產生的焦糊氣味、刺激性和雜氣，增加煙草光亮色澤，有效改善煙草品質，可用于制備煙葉改良噴施菌劑。附圖說明圖1為菌株YTK1在點接于淀粉培養基培養48小時后經即配碘液染色所顯示的淀粉透明圈。圖2為菌株YTK1制成的菌懸液噴施于烘烤前的煙葉表面上，再經烤房烘烤過后所呈現的煙葉外觀形態，左側為CK，右圖為經YTK1處理后煙葉。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本專利技術做進一步詳細說明，但實施例并不對本專利技術做任何形式的限定。除非特別說明，本專利技術采用的試劑、方法和設備為本
常規試劑、方法和設備。實施例1 耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTK1的分離和篩選分離純化：將南雄煙草研究所試驗基地采摘的新鮮煙葉帶回實驗室，稱取5 g新鮮煙葉樣本，用蒸餾水洗凈，然后剪碎葉片置于已滅菌的培養皿中，用3%的雙氧水（H2O2）浸泡4 min（以除去根表面的腐爛物質），無菌水洗滌一次，再用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5 min，無菌水中振動洗滌5～7次，每次5～10 min，并將最后一次洗滌液涂布于LB固體培養基上，以檢測消毒是否徹底。將表面消毒徹底的煙葉樣本接種于80 ml LB液體培養基的250 mL三角瓶中37 ℃，120 r/min擴大培養2天后，于恒溫循環水浴槽中設置溫度80 ℃水浴30 min，殺死非芽孢菌，用滅菌槍頭吸取50本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）YTK1，其特征在于，所述菌株于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），菌種保藏號為GDMCC?No：60033。
【技術特征摘要】
1.一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YTK1，其特征在于，所述菌株于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），菌種保藏號為GDMCC No：60033。2.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTK1呈桿狀，產芽孢，菌落在LB培養基平板上生長速度較快，在液體培養基中形成菌膜，在固體培養基上菌落呈淡黃色，不透明，表面粗糙，邊緣不規則。3.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTK1對濃度為1.5%NaCl、300 μg/mL氨芐青霉素、100 μg/mL鏈霉素和四環素、5 μg/mL氯霉素和紅霉素均具有耐受性；對卡拉霉素、慶大霉素和新霉素耐受性小于5 μg/mL。4.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTK1能利用以淀粉、吐溫40、吐溫80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、蔗糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賀廣生，王勇，張國華，譚志遠，王行，王軍，彭桂香，
申請(專利權)人：中國煙草總公司廣東省公司，華南農業大學，中國煙草總公司河南省公司，廣東省煙草南雄科學研究所，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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