具有增加的碳通量效率的方法和生物技術

本發明專利技術涉及一種非天然存在的微生物，其包括琥珀酰基?CoA合成酶或轉移酶的第一衰減以及琥珀酰基?CoA轉化酶或編碼在具有琥珀酰基?CoA到琥珀酸的凈轉化的多步驟途徑之內的產琥珀酸酶的基因的至少第二衰減。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利技術背景本專利技術提供了非天然存在的微生物，其具有通過氧化的TCA循環從琥珀酰基-CoA到琥珀酸的減少的碳通量。本專利技術還提供使用該微生物減少通過氧化的TCA循環從琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的方法。通過過量CO2生產的碳損失可以來自中心代謝的三個主要路線：戊糖磷酸途徑、乙醛酸支路和氧化三羧酸(TCA)循環。該戊糖磷酸途徑的主要的CO2生成反應是磷酸葡萄糖脫氫酶。在該TCA循環和乙醛酸支路中可促成碳損失的酶包含，例如丙酮酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸氧化酶、α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和蘋果酸酶。碳損失也可以來自其他的代謝反應，其包含，例如甘氨酸裂解系統、甲酸氫裂解酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、丙酮酸氧化酶、乙酰乳酸合酶和2-氧代-4-甲基-3-羧基戊酸脫羧酶、天冬氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫羧酶和參與脂肪酸生物合成的酶。因此，需要用于降低碳損失并提高碳通量效率的替代手段。本專利技術滿足了這種需要，還具有相關的優點。專利技術概述本專利技術涉及一種非天然存在的微生物，其包括琥珀酰基-CoA合成酶或轉移酶的第一衰減以及琥珀酰基-CoA轉化酶或編碼在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的凈轉化的多步驟途徑之內的產琥珀酸酶的基因的至少第二衰減。該琥珀酰基-CoA合成酶可以由sucCD編碼。該琥珀酰基-CoA轉化酶可以是YciA CoA水解酶這種酶。該微生物可以進一步包含吡啶核苷酸轉氫酶的增加的表達，包含其中該吡啶核苷酸轉氫酶由pntAB編碼。該微生物還可以包含非琥珀酰基-CoA合成酶或轉移酶的TCA循環酶的衰減。該微生物可以包含用于從TCA循環中間體或TCA循環底物生產生物衍生化合物的代謝工程化途徑。該生物衍生化合物可以是4-羥基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羥基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己內酰胺或甲基丙烯酸或本文披露的其他化合物。本專利技術涉及用于提高生物衍生化合物的產量的其他遺傳改變。附圖說明圖1示出了生成CO2的中心代謝途徑，包含(1)該戊糖磷酸途徑；(2)完全氧化的TCA循環；以及(3)該乙醛酸支路。縮寫：Glc是葡萄糖，G6P是葡萄糖-6-磷酸，F6P是果糖-6-磷酸，FBP是果糖-1，6-雙磷酸，G3P是甘油醛-3-磷酸，PEP是磷酸烯醇丙酮酸，Pyr是丙酮酸，cit是檸檬酸，Icit是異檸檬酸，AKG是α-酮戊二酸，Succ是琥珀酸，Fum是富馬酸，Mal是蘋果酸，OAA是草酰乙酸，6PGL是6-磷酸葡糖酸內酯，Ru5P是核酮糖-5-磷酸，E4P是赤蘚糖-4-磷酸，S7P是景天庚酮糖-7-磷酸，以及Glx是乙醛酸。專利技術詳述本專利技術提供非天然存在的微生物，其具有通過氧化的TCA循環從琥珀酰基-CoA到琥珀酸的減少的碳通量，其中該微生物包含一種或多種遺傳破損。本專利技術還提供使用該微生物減少通過氧化的TCA循環從琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的方法。如本文所用，術語“非天然存在的”當關于本文提供的微生物使用時，意指該微生物具有至少一種通常不會在相關物種的天然存在的菌株(包括相關物種的野生型菌株)中發現的遺傳改變。遺傳改變包括，例如，引入編碼代謝多肽的可表達的核酸的修飾、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遺傳物質的其他功能中斷。這些修飾包括，例如，相關物種的異源多肽、同源多肽或異源和同源多肽的編碼區和功能片段。其他修飾包括，例如，其中該修飾改變基因或操縱子的表達的非編碼調控區域。示例性代謝多肽包含，例如將琥珀酰基-CoA轉化為琥珀酸的酶或蛋白質、三羧酸(TCA)循環酶、吡啶核苷酸轉氫酶、NADH脫氫酶、泛醇氧化酶、甲基萘醌生物合成酶、甲基萘醇生物合成酶(menaquinol biosynthetic enzyme)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)以及生物衍生的產物生物合成途徑內的酶或蛋白質。代謝修飾是指從其天然存在的狀態發生改變的生化反應。因此，非天然存在的微生物可以具有對編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的遺傳修飾。本文披露了示例性代謝修飾。本專利技術的該非天然存在的微生物可以包含穩定的遺傳改變，這指可以培養超過五代而無改變損失的微生物。一般地，穩定的遺傳改變包括持續超過10代的修飾，具體地，穩定的修飾將持續超過約25代，以及更具體地，穩定的遺傳修飾將超過50代，包括永久地。如本文所用，當關于微生物使用時，術語“分離”意指當相關微生物在自然界中被發現時，基本上不含至少一種組分的生物。該術語包括當在其自然環境中被發現時從部分或全部組分中脫離的微生物。該術語還包括當其在非天然存在的環境中被發現時從部分或全部組分中脫離的微生物。因此，當分離的微生物在自然界中被發現或者當其在非天然存在的環境中培育、儲存或生存時，它部分或全部地從其他物質中分離。分離的微生物的具體例子包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非天然存在的培養基中培養的微生物。如本文所用，術語“微生物”意在指任何作為包含在古菌域、細菌域或真核域的顯微細胞存在的生物。因此，該術語意包括原核或真核細胞或具有顯微尺寸的生物并包括所有種類的細菌、古菌和真細菌以及真核微生物(如酵母和真菌)。該術語還包括任何種類的可被培養用于生產生物化學品的細胞培養物。關于具有參考的基因破壞或其他遺傳改變的微生物使用時，親本微生物或親本的微生物被理解為是指這樣的微生物或菌株，如果將該參考的基因破壞或其他遺傳改變排除在比較之外，則其具有的基因型與具有該參考的基因破壞或其他遺傳改變的微生物基本相似。因此，親本微生物是指菌株的基本上相似的基因型，其中該參考的基因破壞或其他遺傳改變被引入以生成修飾的生物。可以理解的是，親本微生物可以例如，根據是否考慮單個或多個遺傳改變，通過一種以上的遺傳改變(基因添加和/或破壞)而不同。本領域的技術人員將很容易理解這樣的親本微生物的含義，因為該微生物被認為是用于觀察一個或多個遺傳改變的影響的，如本領域中所理解的，適當的對照物。如本文所用，術語“CoA”或者“輔酶A”意在指有機輔因子或者輔基(酶的非蛋白質部分)，它的存在為許多酶(脫輔基酶)的活性所需以形成活性酶系統。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙酰基或者其他酰基基團轉移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙酰基化中起作用。如本文所用，當關于培養或培育條件使用時，術語“基本上厭氧”意指氧量少于液體培養基內溶解的氧的飽和量的約10％。該術語還意在包括在小于約1％的氧的氣氛中保持的液體或固體培養基的密封室。如本文所用，“外源”意指有關分子或有關活性被引入宿主微生物。分子可以例如，通過將編碼核酸引入宿主遺傳物質，如通過整合入宿主染色體或作為非染色體遺傳物質(如質粒)被引入。因此，當關于編碼核酸的表達使用時，該術語指將編碼核酸以可表達的形式引入微生物。當關于生物合成活性使用時，該術語指被引入宿主有關生物的活性。來源可以是例如，表達引入宿主微生物后有關活性的同源或異源編碼核酸。因此，術語“內源”指在宿主內存在的有關分子或活性。同樣，當關于編碼核酸的表達使用時，該術語指包含在微生物體內編碼核酸的表達。術語“異源”指來自與有關物種不同的來源的分子或活性而“同本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種非天然存在的微生物，其包含選自由如下組成的組的遺傳改變：(1)cydA或cydB的衰減，以及選自由如下組成的組的一種或多種遺傳改變：(a)使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(b)由pykF編碼的蛋白質的衰減；(c)由sucCD編碼的蛋白質的衰減；(d)由yciA編碼的蛋白質的衰減；(e)使由ackA編碼的蛋白質以及由pta編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(f)使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(g)由pykA編碼的蛋白質的衰減；(h)由arcA編碼的蛋白質的衰減；(i)由crr編碼的蛋白質的衰減；(j)由clpA編碼的蛋白質的衰減；和(k)由menC編碼的蛋白質的衰減；以及(2)選自由如下組成的組的遺傳改變(a)由sucCD和yciA編碼的蛋白質的衰減；(b)由sucCD和yciA編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(c)由sucCD和yciA編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(d)由sucCD、yciA和cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(e)由sucCD、yciA和menC編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(f)由sucCD、yciA、cydA或cydB和menC編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(g)由sucCD以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減；(h)由sucCD以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減；(i)由sucCD以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(j)由sucCD以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減，以并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(k)由sucCD、yciA以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減；(1)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減；(m)由sucCD、yciA以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(n)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(o)由sucCD、yciA，以及cydA或cydB和menC編碼的蛋白質的衰減；(p)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和menC編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(q)由sucCD和pykF編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(r)由clpA編碼的蛋白質的衰減；(s)由menC編碼的蛋白質的衰減；(t)由menC和cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減；(u)由pykF和/或pykA編碼的蛋白質的衰減；(v)具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(w)cydA或cydB以及sucCD、arcA和crr的衰減，并且具有使由ackA和pta編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(x)cydA或cydB以及arcA的衰減；(y)cydA或cydB的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(z)cydA或cydB以及pykF的衰減；以及(aa)cydA或cydB以及pykF的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變。...

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.27 US 61/921,292;2014.06.17 US 62/013,3901.一種非天然存在的微生物，其包含選自由如下組成的組的遺傳改變：(1)cydA或cydB的衰減，以及選自由如下組成的組的一種或多種遺傳改變：(a)使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(b)由pykF編碼的蛋白質的衰減；(c)由sucCD編碼的蛋白質的衰減；(d)由yciA編碼的蛋白質的衰減；(e)使由ackA編碼的蛋白質以及由pta編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(f)使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(g)由pykA編碼的蛋白質的衰減；(h)由arcA編碼的蛋白質的衰減；(i)由crr編碼的蛋白質的衰減；(j)由clpA編碼的蛋白質的衰減；和(k)由menC編碼的蛋白質的衰減；以及(2)選自由如下組成的組的遺傳改變(a)由sucCD和yciA編碼的蛋白質的衰減；(b)由sucCD和yciA編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(c)由sucCD和yciA編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(d)由sucCD、yciA和cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(e)由sucCD、yciA和menC編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(f)由sucCD、yciA、cydA或cydB和menC編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由cyoB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(g)由sucCD以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減；(h)由sucCD以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減；(i)由sucCD以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(j)由sucCD以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減，以并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(k)由sucCD、yciA以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減；(1)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減；(m)由sucCD、yciA以及cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(n)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(o)由sucCD、yciA，以及cydA或cydB和menC編碼的蛋白質的衰減；(p)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和menC編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(q)由sucCD和pykF編碼的蛋白質的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(r)由clpA編碼的蛋白質的衰減；(s)由menC編碼的蛋白質的衰減；(t)由menC和cydA或cydB編碼的蛋白質的衰減；(u)由pykF和/或pykA編碼的蛋白質的衰減；(v)具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(w)cydA或cydB以及sucCD、arcA和crr的衰減，并且具有使由ackA和pta編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(x)cydA或cydB以及arcA的衰減；(y)cydA或cydB的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變；(z)cydA或cydB以及pykF的衰減；以及(aa)cydA或cydB以及pykF的衰減，并且具有使由pntAB編碼的蛋白質的表達增加的遺傳改變。2.權利要求1任一項所述的非天然存在的微生物，其進一步包含用于從TCA循環中間體或TCA循環底物生產生物衍生化合物的代謝工程化途徑。3.權利要求2任一項所述的非天然存在的微生物，其中，所述生物衍生化合物選自由如下組成的組：4-羥基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羥基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己內酰胺、甲基丙烯酸、異丙醇、長鏈醇類、六亞甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇。4.如權利要求1-2中任一項所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物選自由如下組成的組：細菌、酵母、真菌或適用于發酵過程的其他微生物。5.權利要求4所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物是細菌。6.權利要求5所述的非天然存在的微生物，其中，所述細菌是大腸桿菌。7.權利要求1所述的非天然存在的微生物，其中，該生物衍生化合物的收率相對于缺乏所述遺傳改變是提高的。8.一種生產生物衍生化合物的方法，包含在足以生產所述生物衍生化合物的條件下將權利要求1-7中任一項所述的非天然存在的微生物培養達足夠的時間段。9.一種生物衍生化合物，其由權利要求1-7中任一項所述的非天然存在的微生物或通過權利要求8所述的方法產生。10.一種非天然存在的微生物，其包含琥珀酰基-CoA合成酶或轉移酶的第一衰減以及琥珀酰基-CoA轉化酶或編碼在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的凈轉化的多步驟途徑之內的產琥珀酸酶的基因的至少第二衰減。11.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA合成酶或轉移酶由表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因或與表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因具有至少70％同一性的直系同源物編碼。12.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA合成酶由sucCD編碼。13.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA轉化酶選自編碼表1-11中所列的CoA水解酶、CoA轉移酶或CoA合成酶的基因或與表1-11中所列的基因具有至少70％同一性的直系同源物。14.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA轉化酶是YciA CoA水解酶。15.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，編碼在多步驟途徑之內的所述產琥珀酸酶的所述基因選自編碼表12中所列的一種或多種產琥珀酸酶的基因或與編碼表12中所列的所述一種或多種產琥珀酸酶的基因具有至少70％同一性的直系同源物。16.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，經由氧化三羧酸(TCA)途徑的從琥珀酰基-CoA到琥珀酸的產量的水平相比沒有所述第二衰減的微生物，被減少了25％或更多。17.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于沒有所述第二衰減的微生物，琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性的水平減少了25％或更多。18.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于沒有所述第二衰減的微生物，從琥珀酰基-CoA到琥珀酸的13C通量的水平減少了25％或更多。19.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于沒有所述第二衰減的微生物，每個細胞的O2利用率的水平減少了10％或更多。20.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于沒有所述第二衰減的微生物，經由氧化的TCA的過量CO2的水平減少了10％或更多。21.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其進一步包含吡啶核苷酸轉氫酶的增加的表達。22.權利要求21所述的非天然存在的微生物，其中，所述增加的表達包含上調內源性吡啶核苷酸轉氫酶的表達。23.權利要求21所述的非天然存在的微生物，其中，所述吡啶核苷酸轉氫酶包含質子-移位轉氫酶。24.權利要求21所述的非天然存在的微生物，其中，吡啶核苷酸轉氫酶由pntAB編碼。25.權利要求10所述的非天然存在的微生物，其進一步包含非琥珀酰基-CoA合成酶或轉移酶的TCA循環酶的衰減。26.權利要求25所述的非天然存在的微生物，其中，所述非琥珀酰基-CoA合成酶或轉移酶的TCA循環酶選自琥珀酸脫氫酶、富馬酸酶和蘋果酸脫氫酶。27.權利要求10-26中任一項所述的非天然存在的微生物，其進一步包含用于從TCA循環中間體或TCA循環底物生產生物衍生化合物的代謝工程化途徑。28.權利要求10-27中任一項所述的非天然存在的微生物，其中，所述生物衍生化合物選自由如下組成的組：4-羥基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羥基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己內酰胺、甲基丙烯酸、異丙醇、長鏈醇類、六亞甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇和巴豆基-醇。29.權利要求10-28中任一項所述的非天然存在的微生物，其中包含使NADH脫氫酶Ndh-I、細胞色素bo氧化酶、或NADH脫氫酶Ndh-I和細胞色素bo氧化酶兩者的表達增加的遺傳改變。30.權利要求29所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含編碼所述NADH脫氫酶Ndh-I(nuo)、細胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)、或NADH脫氫酶Ndh-I(nuo)和細胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)兩者的外源性核酸。31.權利要求10-30中任一項所述的非天然存在的微生物，其進一步包...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·P·博加德，羅賓·E·奧斯特豪特，S·J·萬殿，普里蒂·法克雅，梁泰勛，崔正基，
申請(專利權)人：基因組股份公司，
類型：發明
國別省市：美國;US