本發明專利技術公開了一種聚合酶鏈擴增方法，在所述方法中，在用于擴增的上游引物或下游引物的5’端添加一種限制性內切酶序列，在所述引物的5`端標記熒光基團，在引物的中間位置標記能夠特異性地猝滅5`端所述熒光基團的猝滅基團，在所述聚合酶鏈擴增體系中添加所述限制性內切酶，并進行聚合酶鏈擴增反應。本發明專利技術公開的方法擴增速度快、反應靈敏、特異性高，能夠實現核酸的實時、快速及多重檢測分析。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種核酸擴增方法，屬于微生物和分子生物學領域。
技術介紹
在現代生物學和醫學領域，核酸擴增是一種不可缺少的技術，廣泛應用于臨床檢測、基礎研究、考古研究、流行病研究、轉基因研究等領域。在已開發設計的核酸擴增技術中，PCR擴增技術是第一個被建立的體外核酸擴增技術，具有劃時代意義，該技術已經被廣泛應用于醫學、生物及化學相關領域。運用PCR技術進行核酸擴增時，需要重復三個熱循環步驟：核酸解鏈(95℃)，引物退火(45-65℃)，延伸擴增(72℃)。當PCR擴增結束后，其產物的檢測需要一套復雜的流程和設備，該過程耗時、耗力。因此，PCR技術的應用受到后續檢測條件的限制，這些劣勢阻礙了PCR技術的廣泛應用，尤其在經濟落后的地區、快速診斷及實時檢測領域。對于生物及醫學相關研究領域而言，非常有必要發展一個操作簡單、檢測快速、經濟有效的核酸擴增方法。在過去十五年來，為了克服傳統PCR技術的后續檢測，許多以PCR技術為基礎的實時擴增檢測技術應運而生。相比較普通的PCR技術而言，實時PCR技術不需要后續的檢測，核酸擴增及檢測同時進行，整個實時PCR反應過程僅僅需要1.5小時，有利于實現快速診斷。此外，由于消除了后續的檢測過程，有效的避免了后續操作導致的污染。到目前為止，已研發的實時PCR擴增技術有10余種，根據實時檢測原理，可用分為以下兩種類型。第一種為依賴雙鏈DNA結合分子的檢測，如SYBR Green。此類基團在游離的狀態下發出微弱的熒光，當與雙鏈DNA分子的小溝結合后，熒光強度增強，其強度與雙鏈DNA的數量相關。由于此類雙鏈結合分子沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結合發光，對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，因此本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發生。此外，依賴于雙鏈結合的實時PCR技術極難實現多重檢測。第二種為依賴寡核苷酸探針的檢測，如Taqman探針。在寡核苷酸探針中，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發射熒光。一分子的產物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。然而，此類檢測需要針對靶序列的第三區域設計探針，對于一些保守性比較差的特異區域，很難設計此類探針進行實時檢測。檢測一個核酸靶標需要兩條引物及一條探針，極易形成二聚體，影響擴增及檢測。此外，探針的設計工藝及修飾比較復雜。因此，這些實時PCR擴增技術的便捷性、實用性以及可操作性有待提高。為了克服現有實時PCR相關技術的劣勢，實現快速、簡單、敏感及特異的核酸序列擴增，有必要建立一種操作簡單、經濟實用、反應速度快、特異性強的核酸擴增技術。另外，在微生物領域存在著一類細菌，它們在自然界分布廣泛，也在很大程度上威脅著人類健康，但是其檢測技術仍然受到現有技術的局限，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia；S.pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；S.aureus)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis；E.faecalis)就是這樣一類細菌。肺炎鏈球菌在自然界中分布廣泛，常生活在正常人的鼻腔中，該菌主要引起大葉性肺炎以及氣管炎、中耳炎、腦膜炎、胸膜炎、心內膜炎、敗血癥等疾病。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。該菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。糞腸球菌是革蘭氏陽性、過氧化氫陰性球菌，是人和動物腸道內主要菌群之一。該菌是內源性和外源性醫院感染的第二大病原菌，檢出率僅次于大腸桿菌。在引起尿路感染的致病菌中，屎腸球菌感染居第2位；腹腔、盆腔感染，腸球菌居第3位；敗血癥，腸球菌居第3位，病死率為12.6％～57％。此外，這三種病原體也是重癥加強護理病房最常見的病原菌，從而受到全球衛生部門的高度關注，成為各國的重大公共衛生問題。目前對于肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及糞腸球菌的診斷主要依賴于傳統的增菌培養和生化鑒定，該方法耗時大約5到7天，包括增菌、選擇培養及后續的生化鑒定，其劣勢耗時耗力，生化結果的判讀依賴于人的主觀判斷，導致結果重復差，易錯判。隨著核酸診斷技術的快速發展，在臨床及基礎實驗室，PCR技術已經被用于診斷病原體，然而，該技術需要后續的電泳操作，無法滿足快速便捷檢測的需要。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療、醫院感染的控制以及三種病原體的流行病學調查，研發一個省時、省力和特異性較高的診斷方法，能夠同時檢測和鑒定三種病原體成為必要。
技術實現思路
為了實現上述目標，本專利技術設計了一種新型的依賴于傳統PCR擴增的實時核酸檢測方法，命名為限制性內切酶介導的依賴于PCR擴增的實時核酸檢測方法(Endonuclease Restriction-Mediated Real-Time Polymerase Chain Reaction，ET-PCR)。在所述方法中，在用于擴增的上游引物或下游引物的5’端添加一種限制性內切酶序列，在所述引物的5`端標記熒光基團，在引物的中間位置標記能夠特異性地猝滅5`端所述熒光基團的猝滅基團，在所述聚合酶鏈擴增體系中添加所述限制性內切酶，并進行聚合酶鏈擴增反應。在一個優選的實施方案中，在添加于所述引物5’端的所述限制性內切酶序列的5’端添加一個堿基T。更為優選地，所述限制性內切酶為BstUI，所述限制性內切酶序列為CGCG。在一個優選的實施方案中，所述熒光基團與淬滅基團的組合可以為：Hex和BHQ1、Cy5和BHQ2、或FAM和BHQ1。在本專利技術中，針對肺炎鏈球菌的特異基因ply、金黃色葡萄球菌的特異基因nuc和糞腸球菌的特異基因Ef0027作為模型檢測靶標驗證ET-PCR檢測技術，分別設計三套ET-PCR擴增引物，旨在驗證、評價ET-PCR擴增技術及建立針對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌三種病原體的快速、敏感和特異的ET-PCR檢測體系。在一個優選的實施方案中，所述上游引物與下游引物為下列序列組合：(1)SEQ ID NO.1和3(該組合用于檢測ply基因,)；(2)SEQ ID NO.4和6(該組合用于檢測nuc基因)；或(3)SEQ ID NO.7和9(該組合用于檢測Ef0027基因)。本專利技術還提供了上述方法在多重目的基因擴增中的應用，在所述擴增體系中，在每對用于不同目的基因擴增的上游引物或下游引物的5’端標記不同的熒光基團，并在引物中間標記能夠特異性地猝滅5`端所述熒光基團的猝滅基團。在一個優選的實施方案中，待擴增的所述目的基因為2或3個，當待擴增的所述目的基因為2個時，所述上游引物與下游引物為下列三種序列組合中任意兩種組合；當待擴增的所述目的基因為3個時，所述上游引物與下游引物包括下列全部三種序列組合：(1)SEQ ID NO.1和3；(2)SEQ ID NO.4和6；(3)SEQ ID NO.7和9。最后，本專利技術提供了一種聚合酶鏈擴增試劑盒，所述試劑盒含有Ta本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種聚合酶鏈擴增方法，其特征在于，在用于擴增的上游引物或下游引物的5’端添加一種限制性內切酶序列，在所述引物的5`端標記熒光基團，在引物的中間位置標記能夠特異性地猝滅5`端所述熒光基團的猝滅基團，在所述聚合酶鏈擴增體系中添加所述限制性內切酶，并進行聚合酶鏈擴增反應。
【技術特征摘要】
1.一種聚合酶鏈擴增方法，其特征在于，在用于擴增的上游引物或下游引物的5’端添加一種限制性內切酶序列，在所述引物的5`端標記熒光基團，在引物的中間位置標記能夠特異性地猝滅5`端所述熒光基團的猝滅基團，在所述聚合酶鏈擴增體系中添加所述限制性內切酶，并進行聚合酶鏈擴增反應。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在添加于所述引物5’端的所述限制性內切酶序列的5’端添加一個堿基T。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性內切酶為BstUI，所述限制性內切酶序列為CGCG。4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述熒光基團與淬滅基團的組合可以為：Hex和BHQ1、Cy5和BHQ2、或FAM和BHQ1。5.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述上游引物與下游引物為下列序列組合：(1)SEQ ID NO.1和3；(2)SEQ ID NO.4和6；或(3)SEQ ID NO.7和9。6.權利要求1-3任一所述方法在多重目的基因擴增中的應用，其特征在于，在所述擴增體系中，在每對用于不同目的基因擴增的上游引物或下游引物的5’端標記不同的熒光基團，并在引物中間標記能夠特異性地猝滅5`端所述熒光基團的猝滅基團。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：葉長蕓，王毅，王艷，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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