本發明專利技術公開了一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物及制備方法及應用，該熒光探針底物具有如下式的結構式：?合成方法以下6-氨基-2-萘甲酸為原料合成。采用所述的二肽基肽酶IV的熒光探針底物，與含二肽基肽酶IV的生物樣品混合后進行酶促反應，通過定量檢測單位時間內的底物消除率或其去二肽基產物的生成率來定量測定不同生物體系中DPP-IV的活性。本發明專利技術的探針底物作為特異性的DPP-IV單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測DPP-IV的活性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種熒光探針底物及制備方法及應用，特別涉及一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物及制備方法及應用，屬于化學領域。
技術介紹
二肽基肽酶-IV（DPP-IV, CD26, EC 3.4.14.5）是以二聚體形式存在的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于哺乳動物臟器的上皮細胞及血管內皮細胞，其中在腎臟中表達最高，也能以溶解形式存在于體液中。作為重要的I相代謝酶，DPP-IV能特異性地催化多肽鏈N末端第2 位的氨基酸殘基脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）肽鍵水解斷裂，從而參與體內多種生物活性多肽的激活、部分或完全失活，如腸促胰島素、神經肽、胃泌素釋放肽、生長激素釋放激素等。DPP-IV也在糖代謝過程中扮演重要角色，已經成為了治療2型糖尿病新靶點，同時也被FDA批準為重要的藥物作用靶點。另外它還是細胞膜受體和共刺激分子，從而參與機體的免疫調節、細胞移行、細胞黏附和細胞調亡過程，故與多種疾病的發生發展密切相關。研究表明，DPP-IV在一些腫瘤細胞中高表達，如結腸癌、原發性肺癌、前列腺癌、卵巢癌等，利用DPP-IV代謝活化機制，以DPP-IV為潛在靶點，可以設計靶向性的抗癌前藥。臨床研究表明許多疾病如口腔癌、結腸癌、肺癌、腎病、肝病等會引起患者血液或尿液DPP-IV含量顯著改變，使血液或尿液中的DPP-IV可作為這些疾病診斷的標志物。因此，開發DPP-IV檢測方法具有廣闊的臨床應用前景，特別是血液、尿液中DPP-IV活性檢測對疾病的早期診斷，活細胞和活組織層面開展DPP-IV實時定量檢測和功能成像，高效篩選DPP-IV抑制劑作為糖尿病治療的候選藥物，及DPP-IV功能異常與疾病發生發展間的關系等研究等。無論是疾病的診斷和治療，還是對疾病發病機理的研究，都必須要借助于精準高效的檢測手段。傳統的代謝酶的定量評估技術主要有以下三種：1）基于抗體的Elisa或Western檢測技術；2）借助LC-MS/MS技術對目標酶特異性肽段進行分析及定量的蛋白組學技術；3）借助特異性探針分子的目標酶活性定量評估技術。與傳統代謝酶的定量評估技術相比，熒光探針檢測具有以下突出優勢：1）操作簡單、易高通量；2）高靈敏度、樣品需求量小，檢測靈敏度可達皮摩爾級；3）熒光成像技術可以實現對活細胞或組織水平的精確定位及實時動態檢測；4）借助熒光探針分子可實現亞毫秒時間和亞納米空間的高分辨率檢測。因此，開發實用的DPP-IV熒光探針檢測具有重要的應用價值。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物及制備方法及應用。本專利技術所提供的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物，所述的熒光探針底物具有如下式的結構式：R為甲基或乙基或丙基或丁基。本專利技術所提供的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的制備方法，包括以下步驟：（1）以下式所示的6-氨基-2-萘甲酸為起始原料，經過酸催化酯化反應合成下式所示的6-氨基-2-萘甲酸酯類化合物，反應式如下：（2）采用式所示的1當量的6-氨基-2-萘甲酸酯類化合物在0.5-2當量的N-羥基苯并三氮唑、0.5-2當量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、1-3當量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯存在下，與1-3當量的叔丁氧羰基甘氨酸基脯氨酸，在20-30℃攪拌反應24-48小時，生產式所示的產物，反應式如下：（3）將步驟（2）生成的產物經柱層析純化，再經三氟乙酸酸催化，20-30℃攪拌反應4-10小時脫除叔丁氧羰基生成式所示的二肽基肽酶IV的熒光探針底物；反應式如下：上述各反應式中，R為甲基或乙基或丙基或丁基。本專利技術的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的應用，所述的探針底物具有式所述的結構式，采用式所示的化合物作為二肽基肽酶IV的熒光探針底物，與含二肽基肽酶IV的生物樣品混合后進行酶促反應，通過定量檢測單位時間內的底物消除率或其去二肽基產物的生成率來定量測定不同生物體系中DPP-IV的活性。本專利技術的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的應用，所述的探針底物具有式所述的結構式，所述的探針底物可用于DPP-IV抑制劑或誘導劑的快速篩選；或DPP-IV抑制及誘導能力的定量評估，進一步的，上述應用中具體的測定方法如下：A探針底物濃度為1/10~10 Km，Km為酶促反應速度達到最大反應速度一半時所對應的底物濃度；B 以PBS緩沖液作為DPP-IV孵育體系，孵育體系pH值介于5.5~10.5之間，孵育溫度在20~60℃之間，在該體系中加入步驟A濃度的探針底物進行反應；C. 反應時間為5~120分鐘，確保以上底物相應的N-去二肽基化產物達到定量限且底物轉化率不超過20%時終止反應；D. 測定單位時間內底物減少量或N-去二肽基化產物生成量作為DPP-IV活性的評價指標；進一步的，步驟B中孵育溫度為37℃，孵育體系pH值為7.4。本專利技術的積極有益技術效果在于：本專利技術的探針底物作為特異性的DPP-IV單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測DPP-IV的活性，尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌克隆表達體系生產的DPP-IV的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中DPP-IV的活性標定。選用本專利技術的探針底物及測定方法檢測DPP-IV單酶體外活性具有以下突出優勢：(1) 特異性：該探針底物可被DPP-IV高特異性地代謝成一個代謝產物，即N-去二肽化產物；(2) 廉價易得：GP-ANC可經化學合成獲得，合成工藝簡單易行；(3) 易高通量檢測：可在實驗室常見各類熒光酶標儀及臨床大生化儀上測定，可利用96或386微孔板進行批量檢測。附圖說明圖1是 6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的合成路線。圖2是 6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的1H-NMR譜圖。圖3 是6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的13C-NMR譜圖。圖4.是6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的選擇性圖。圖5是 DPP-IV的定量標準曲線。具體實施方式為了更充分的解釋本專利技術的實施，提供本專利技術的實施實例，這些實施實例僅僅是對本專利技術的闡述，不限制本專利技術的范圍。本專利技術實施例中所采用的設備及其型號為：熒光發射/激發光譜是由SynergyH1全功能微孔板檢測儀檢測完成；NMR譜圖是由核磁共振波譜儀（ Avance II 400MHz）檢測完成。本專利技術中Boc-Gly-Pro-OH指N-[叔丁氧羰基]甘氨酰-L-脯氨酸，其中文同義詞還有：BOC-甘氨酸-L-脯氨酸；Boc指叔丁氧羰基 .實施例1：6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的合成，即式中的R為甲基，附圖1給出了其合成路線。附圖1中化合物2的合成室溫下，將6-氨基-2-萘甲酸（561.2 mg, 3 mmol）加入 甲醇（50 mL）溶液中，攪拌下滴加濃硫酸（0.5 mL），加完后回流反應，反應完畢后，除溶劑，飽和碳酸氫鈉溶液調pH值至7-8，每次采用50 mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，采用30 mL水洗、30 mL飽和氯化鈉溶液洗，采用無水硫酸鈉干燥，干燥充分后，蒸除溶劑，得附圖1中的化合物2，為淡本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物，其特征在于：所述的熒光探針底物具有如下式的結構式：R為甲基或乙基或丙基或丁基。
【技術特征摘要】
1.一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物，其特征在于：所述的熒光探針底物具有如下式的結構式：R為甲基或乙基或丙基或丁基。2.一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）以下式所示的6-氨基-2-萘甲酸為起始原料，經過酸催化酯化反應合成下式所示的6-氨基-2-萘甲酸酯類化合物，反應式如下：（2）采用式所示的1當量的6-氨基-2-萘甲酸酯類化合物在0.5-2當量的N-羥基苯并三氮唑、0.5-2當量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、1-3當量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯存在下，與1-3當量的叔丁氧羰基甘氨酸基脯氨酸，在20-30℃攪拌反應24-48小時，生產式所示的產物，反應式如下：（3）將步驟（2）生成的產物經柱層析純化，再經三氟乙酸酸催化，20-30℃攪拌反應4-10小時脫除叔丁氧羰基生成式所示的二肽基肽酶IV的熒光探針底物；反應式如下：上述各反應式中，R 為甲基或乙基或丙基或丁基。3.一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的應用，所述的探針底物具有式所述的結構式，其特征在于：采用式所示的化合物作為二肽基肽酶IV的熒光探針底物，與含...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉林，夏寧，
申請(專利權)人：安陽師范學院，
類型：發明
國別省市：河南;41
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