具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)所述ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體為將ATP敏感核苷酸雙鏈封裝在偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜內(nèi)形成的納米囊泡，所述ATP敏感核苷酸雙鏈由偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈和偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自組裝形成，所述偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜由腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和膽固醇組成，腫腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、膽固醇的摩爾比為(2～8)：(42～78)：(20～50)。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了上述脂質(zhì)體的制備方法。該熒光探針脂質(zhì)體兼具腫瘤主動(dòng)靶向性、ATP敏感智能熒光開(kāi)光和體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功能，并且制備工藝簡(jiǎn)單。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于影像試劑領(lǐng)域，具體涉及一種熒光探針脂質(zhì)體。
技術(shù)介紹
腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的重大疾病。目前腫瘤確診時(shí)，絕大多數(shù)腫瘤患者處于中晚期，治療方法主要以手術(shù)、放療、化療為主。而腫瘤中晚期患者治療后極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、耐藥、轉(zhuǎn)移以及并發(fā)癥，這是治療失敗和病人死亡的主要原因。因此，開(kāi)展腫瘤早期診斷，對(duì)于提高治療效果，減少腫瘤患者死亡率具有重大意義。熒光示蹤技術(shù)是指將能發(fā)熒光的物質(zhì)導(dǎo)入所要跟蹤或顯影的細(xì)胞或組織中，利用熒光特性提供被研究對(duì)象的信息。該技術(shù)具有高靈敏度和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)。然而目前的熒光探針存在缺乏腫瘤靶向性和智能開(kāi)關(guān)熒光等問(wèn)題，造成非腫瘤組織熒光強(qiáng)度高，干擾腫瘤組織熒光成像，難以實(shí)現(xiàn)早期/小體積腫瘤的準(zhǔn)確示蹤。現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道了一種三磷酸腺苷(ATP)觸發(fā)熒光開(kāi)關(guān)的膠束，可作為熒光探針用于活細(xì)胞分子影像。該膠束的分子結(jié)構(gòu)為5’-Lipid-(PEG)2-Dabycl(熒光淬滅劑)-GACCTGGGGGAGTATTGCGGAAGGTT-(PEG)6-CCAGGTC-TMR(熒光分子)-3’，在細(xì)胞外低濃度ATP環(huán)境中呈環(huán)狀，此時(shí)熒光分子和熒光猝滅劑距離很近，熒光被淬滅，處于關(guān)閉狀態(tài)；在細(xì)胞內(nèi)高濃度ATP環(huán)境中，膠束分子構(gòu)型變化，環(huán)狀解開(kāi)，熒光分子和熒光淬滅劑距離增大，使熒光復(fù)原，熒光信號(hào)開(kāi)啟，實(shí)現(xiàn)熒光顯像(CuichenWuetal.ACSNANO,2013,7:5724-5731)。該膠束作為熒光探針可在體內(nèi)有效傳遞，進(jìn)入細(xì)胞，并具有高信號(hào)-低背景比值，優(yōu)良的選擇性和生物相容性，但存在以下問(wèn)題：1、僅依靠納米尺寸的增強(qiáng)滲透和滯留(EPR)效應(yīng)達(dá)到腫瘤部位，無(wú)主動(dòng)靶向性，靶向效率差，文章沒(méi)有提供體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)；2、PEG鏈太短，難以實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)的效果；3、需要合成含寡核苷酸、聚乙二醇和二脂肪酰基脂質(zhì)的雜化分子，合成步驟多，合成難度大，純化操作復(fù)雜。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用，該熒光探針脂質(zhì)體兼具腫瘤主動(dòng)靶向性、ATP敏感智能熒光開(kāi)光和體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功能，并且制備工藝簡(jiǎn)單。本專利技術(shù)所述ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體為將ATP敏感核苷酸雙鏈封裝在偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜內(nèi)形成的納米囊泡，所述ATP敏感核苷酸雙鏈由偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈和偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自組裝形成，所述偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜由腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和膽固醇組成，腫腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、膽固醇的摩爾比為(2～8)：(42～78)：(20～50)。上述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，所述偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈為偶聯(lián)熒光染料cy3、cy5、cy5.5或cy7的ATP敏感核苷酸單鏈。上述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，其特征在于所述ATP敏感核苷酸單鏈的核苷酸序列為序列表中SEQIDNO：1所述。上述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，所述偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈為偶聯(lián)熒光淬滅劑4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈。上述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，所述腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺為末端氨基酸為半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環(huán)狀多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸為半胱氨酸的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸為半胱氨酸的轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺中的一種。上述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，所述腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺為腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一種。上述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，所述磷脂為卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂膽堿中的一種。本專利技術(shù)所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體的制備方法，工藝步驟如下：(1)將末端為半胱氨酸的腫瘤靶向多肽與磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺按摩爾比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇的用量以所述混合溶液磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺的濃度為1～10mmol/L計(jì)，將所得混合溶液在攪拌下于室溫反應(yīng)20～28小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后除去反應(yīng)液中的甲醇，即得腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺；(2)將步驟(1)所得腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、膽固醇按摩爾比為(2～8)：(42～78)：(20～50)溶于氯仿和甲醇組成的復(fù)合溶劑中，得到混合溶液，復(fù)合溶劑的用量以所得混合溶液中磷脂和膽固醇的濃度為1～10mmol/L計(jì)，減壓蒸餾除去混合溶液中的復(fù)合溶劑得到偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜；(3)將偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈和偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈按摩爾比1:1加入去離子水得混合液，去離子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸單鏈的濃度為0.1～10mmol/L計(jì)，在室溫下攪拌10～60分鐘，使偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈和偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自組裝形成ATP敏感核苷酸雙鏈；(4)將步驟(3)所得ATP敏感核苷酸雙鏈與步驟(2)所得偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜按照質(zhì)量比1：(10～50)混合后于40～60℃水化一小時(shí)，得到磷脂和膽固醇的濃度為1～10mmol/L的懸液，將所得懸液水浴超聲5～30分鐘，再依次過(guò)400納米、200納米和100納米的多聚碳酸酯膜，然后采用凝膠排阻層析柱分離純化后即得到具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體。上述方法中，所述末端為半胱氨酸的腫瘤靶向多肽為末端為半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的環(huán)狀多肽(cRGD-cys)、末端為半胱氨酸的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2多肽(Her-2-cys)、末端為半胱氨酸的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin-cys)中的一種；所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺(DSPE-PEG20本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，其特征在于所述ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體為將ATP敏感核苷酸雙鏈封裝在偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜內(nèi)形成的納米囊泡，所述ATP敏感核苷酸雙鏈由偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈和偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自組裝形成，所述偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜由腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和膽固醇組成，腫腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、膽固醇的摩爾比為(2～8)：(42～78)：(20～50)。

【技術(shù)特征摘要】
1.具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，其特征在于所述ATP敏感熒
光探針脂質(zhì)體為將ATP敏感核苷酸雙鏈封裝在偶聯(lián)有腫瘤靶向多肽的脂質(zhì)雙分子層膜內(nèi)形成
的納米囊泡，所述ATP敏感核苷酸雙鏈由偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈和偶聯(lián)熒光淬
滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自組裝形成，所述偶聯(lián)有腫瘤靶向多
肽的脂質(zhì)雙分子層膜由腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和膽固醇組成，
腫腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、膽固醇的摩爾比為(2～8)：(42～78)：
(20～50)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，其特征
在于所述偶聯(lián)熒光染料的ATP敏感核苷酸單鏈為偶聯(lián)熒光染料cy3、cy5、cy5.5或cy7的ATP
敏感核苷酸單鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，其特征
在于所述ATP敏感核苷酸單鏈的核苷酸序列為序列表中SEQIDNO：1所述。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光
探針脂質(zhì)體，其特征在于所述偶聯(lián)熒光淬滅劑的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈為偶聯(lián)熒光淬滅劑
4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互補(bǔ)單鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光
探針脂質(zhì)體，其特征在于所述腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺為末端氨基酸為
半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環(huán)狀多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基
酸為半胱氨酸的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸
為半胱氨酸的轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體，其特征
在于所述腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺為腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二硬脂酰磷脂
酰乙醇胺-聚乙二醇2000、腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、腫
瘤靶向多肽偶聯(lián)的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、腫瘤靶向多肽偶聯(lián)的二月桂酰基磷
脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光
探針脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂為卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂膽堿中的一種。
8.一種具有腫瘤靶向和示蹤作用的ATP敏感熒光探針脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于
工藝步驟如下：
(1)將末端為半胱氨酸的腫瘤靶向多肽與磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺按摩

\t爾比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇的用量以所述混合溶液中磷脂酰乙醇胺-聚...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李莉，林藝，顧忠偉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：四川大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：四川;51