本發(fā)明專利技術(shù)屬于水稻遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種對水稻銅吸收和分配具有重要調(diào)控作用的蛋白OsSPL9及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所提供的水稻OsSPL9蛋白及其編碼基因在過表達(dá)的條件下，可引起水稻體內(nèi)銅元素含量的增加。因此，通過基因工程的方法能利用該基因有效地調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)銅元素的含量，獲得具有高含量有機銅的作物，對于增加飼料利用效率和減少環(huán)境污染均具有重要意義。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)計一種通過過表達(dá)水稻OsSPL9基因增加水稻體內(nèi)銅元素含量的方法及其在飼料中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
微量元素是維持動物生命和生產(chǎn)不可缺少的營養(yǎng)素之一，具有重要的營養(yǎng)生理功能。銅是一種重要的微量元素，在動物生長繁殖、新陳代謝、機體造血、維持生長性能等方面具有不可替代的重要作用，是動物正常生長發(fā)育所必需的。在動物養(yǎng)殖中，銅元素(主要為硫酸銅)常常被添加到動物飼料中，作為生長促進(jìn)劑和抗菌劑而使用。但無機銅對微量元素鐵和鋅具有拮抗作用，能導(dǎo)致鋅和鐵的排出量增加，造成動物體內(nèi)鐵和鋅的缺乏；同時，糞便中殘留的無機銅也會污染環(huán)境。另外，前人的研究表明動物對有機銅的利用效率比無機銅更高。因此，開展高效有機銅的研發(fā)，在促進(jìn)動物生長的前提下，降低飼料中無機銅的添加量，減少或消除糞便中殘留的銅對環(huán)境的污染具有重要意義。本申請專利通過轉(zhuǎn)基因的手段，獲得具有高含量有機銅的作物，對于增加飼料利用效率和減少環(huán)境污染均具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種通過過表達(dá)水稻基因OsSPL9增加水稻體內(nèi)銅元素含量的方法及其在飼料中的應(yīng)用。所述基因可為如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且過表達(dá)后增加植物體內(nèi)銅元素含量的的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且過表達(dá)后增加植物體內(nèi)銅元素含量的的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本專利技術(shù)的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本專利技術(shù)的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接根據(jù)表型篩選目的植物。擴增所述基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本專利技術(shù)的保護范圍。本專利技術(shù)還保護一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述基因?qū)肽康闹参镏校玫襟w內(nèi)銅元素含量增加的轉(zhuǎn)基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。本專利技術(shù)設(shè)計一種通過過表達(dá)水稻基因OsSPL9的方法，增加水稻體內(nèi)銅元素含量方法及其在飼料中的應(yīng)用。因此，通過基因工程的方法能利用該基因有效地調(diào)節(jié)、控制植物體內(nèi)銅元素含量，在動物飼料的生產(chǎn)應(yīng)用中具有重要意義。附圖說明圖1所示OsSPL9過表達(dá)載體。圖2所示為轉(zhuǎn)基因植株中的OsSPL9表達(dá)分析。圖3所示為OsSPL9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株銅元素含量分析。圖4所示為OsSPL9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的田間數(shù)據(jù)分析。圖5所示為OsSPL9過表達(dá)對COPT1、COPT5、COPT7表達(dá)的影響。圖6所示為OsSPL9過表達(dá)對miR408、miR528的表達(dá)影響。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術(shù)，但并不限定本專利技術(shù)。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次或以上重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1 OsSPL9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的獲得AtSPL7基因是擬南芥中一個對于銅吸收和分配均具有重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，在本研究中通過進(jìn)化和共線性分析獲得了AtSPL7在水稻的同源基因OsSPL9。通過PCR擴增獲得OsSPL9的全長cDNA(F:CTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGACGCCCCCGGCG，R:GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATGATGAGTAGTTCCTAG)，然后連接到由玉米Ubiquin啟動子啟動的載體pTCK303上(圖1)，通過電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404(Cat.No.18313-015，Invitrogen公司)中，獲得了OsSPL9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。實施例2 轉(zhuǎn)基因植株中的OsSPL9表達(dá)分析為了檢測轉(zhuǎn)基因植株中OsSPL9基因的過表達(dá)水平，我們設(shè)計了OsSPL9特異引物(F:AATGCAGCTTCTGGAGAGGA，R:AGGCAGCGTTAAGCCATCTA)；取水稻幼苗提取RNA，進(jìn)行熒光定量分析,將OsSPL9基因的熒光信號(以Ct值表示)與水稻基因UBC基因(內(nèi)參基因)的熒光信號(以Ct值表示)根據(jù)公式(其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)計算出的值作為OsSPL9基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，與對照材料日本晴相比，過表達(dá)株系OE2，OE19，OE23，OE30，OE32中OsSPL9基因的表達(dá)量都有2到4倍增加(圖2)。實施例3 OsSPL9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株銅元素含量增加對過表達(dá)株系進(jìn)行銅元素含量測定，樣品經(jīng)過5HNO3:1HClO4混合酸消化處理后，采用ICP-OES(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy)方法測定銅元素含量。我們發(fā)現(xiàn)在幼苗時期，地上部分包括葉片和葉鞘中銅元素均增加(圖3a，3b)；在成熟期，過表達(dá)株系表現(xiàn)為種子中銅含量增加，而其他組織沒有明顯變化。通過過表達(dá)水稻OsSPL9基因，我們成功獲得了銅含量增加的轉(zhuǎn)基因水稻材料(圖3c，3d)。實施例4 銅含量增加的OsSPL9過表達(dá)植株種子更易消化吸收為了驗證銅含量增加的水稻種子是否更易消化吸收，我們參照Tang和Wang的方法，對野生型的種子和轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行了體外發(fā)酵實驗(Tang,S.,Tan,Z.,Zhou,C.,Jiang,H.,Jiang,Y.and Sheng,L.(2006)A comparison of in vitro fermentation characteristics of different botanical fractions ofmaturemaize stover.J本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
分離的、合成的或重組的DNA分子，其包括：(a)?SEQ?ID?NO：2或3所示的序列；(b)?DNA分子，其編碼與SEQ?ID?NO：2或3所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽；(c)與SEQ?ID?NO：2或3所示的序列具有至少90%同源性的DNA分子或編碼其酶活性片段的序列；(d)?在0.1×SSPE、?0.1×SSC或0.1％?SDS的溶液中，65℃條件下與(a)?、(b)、(c)中的DNA序列雜交、洗膜且過表達(dá)后的DNA分子；(e)?與SEQ?ID?NO：2或3所示序列互補的序列；(f)?由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQ?ID?NO：2或3所示序列的序列之一。
【技術(shù)特征摘要】
1.分離的、合成的或重組的DNA分子，其包括：(a) SEQ ID NO：2或3所示的序列；(b) DNA分子，其編碼與SEQ ID NO：2或3所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽；(c)與SEQ ID NO：2或3所示的序列具有至少90%同源性的DNA分子或編碼其酶活性片段的序列；(d) 在0.1×SSPE、 0.1×SSC或0.1％ SDS的溶液中，65℃條件下與(a) 、(b)、(c)中的DNA序列雜交、洗膜且過表達(dá)后的DNA分子；(e) 與SEQ ID NO：2或3所示序列互補的序列；(f) 由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQ ID NO：2或3所示序列的序列之一。2.分離的、合成的或重組的多肽，其包括：(a) SEQ ID NO：1所示的序列；(b)權(quán)利要求1所述DNA分子編碼的氨基酸序列；(c)權(quán)利要求1所述DNA分子編碼的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加且與水稻體內(nèi)銅元素含量相關(guān)的由(a)或(b)衍生的多肽。3.含有權(quán)利要求1所述DNA分子或權(quán)利要求2所述多肽的重組表達(dá)載體或表...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張德春，唐鳴鳳，陳彩艷，毛東海，朱玉興，劉成兵，
申請(專利權(quán))人：三峽大學(xué)，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北;42
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