用于癌癥免疫療法的CD123特異性嵌合抗原受體制造技術

本發明專利技術涉及嵌合抗原受體(CAR)，其是能夠重新定向免疫細胞針對選定的膜抗原的特異性和反應性的重組嵌合蛋白，并且更具體地，其中胞外配體結合是源自CD123單克隆抗體的scFV，賦予針對CD123陽性細胞的特異性免疫性。賦予這種CAR的工程化免疫細胞特別適用于治療淋巴瘤和白血病。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及嵌合抗原受體(CAR)，其是能夠針對選定的膜抗原重新定向免疫細胞特異性和反應性的重組嵌合蛋白，并且更具體地其中胞外配體結合是源自CD123單克隆抗體的scFV，賦予對于CD123陽性細胞的特異性免疫性。已經確定與正常的造血干細胞相比，白細胞介素3受體α鏈(CD123)經常在白血病腫瘤細胞上過表達(特別是在急性骨髓性白血病(AML)的情況下)。根據本專利技術的被賦予CAR的工程化免疫細胞在治療淋巴瘤和白血病方面顯示出更高的效力。
技術介紹
過繼性免疫療法(adoptive immunotherapy)(其涉及體外生成的自體抗原特異性T細胞的轉移)，是治療病毒感染和癌癥的有希望的策略。可以通過抗原特異性T細胞的擴增或T細胞的重新定向(通過基因工程)來產生用于過繼性免疫療法的T細胞(Park,Rosenberg et al.2011)。病毒抗原特異性T細胞的轉移是用于治療移植相關的病毒感染和罕見的病毒相關的惡性腫瘤的已建立的程序。類似地，在治療黑色素瘤中，腫瘤特異性T細胞的分離和轉移已顯示是成功的。通過轉基因T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)的基因轉移，已成功地產生在T細胞中的新型特異性(Jena,Dotti et al.2010)。CAR是合成受體，其由與單融合分子中的一個或多個信號結構域相關聯的靶向部分組成。通常，CAR的結合部分由單鏈抗體(scFv)的抗原結合結構域組成，包含通過柔性接頭(linker)結合的單克隆抗體的輕片段和可變片段。也已成功地使用基于受體或配體結構域的結合部分。第一代CAR的信號結構域(signaling domain)是源自CD3ζ或Fc受體γ鏈的胞質區。第一代CAR已顯示出成功地重新定向T細胞的細胞毒性，然而，它們未能提供體內長期擴增和抗腫瘤活性。已單獨地(第二代)或組合地(第三代)加入來自共刺激分子(包括CD28、OX-40(CD134)、和4-1BB(CD137))的信號結構域，以增強生存率和增加CAR修飾T細胞的增殖。CAR已成功地使得T細胞針對在來自各種惡性腫瘤(包括淋巴瘤和實體瘤)的腫瘤細胞的表面上表達的抗原重新定向(Jena,Dotti et al.2010)。同時，用于急性骨髓性白血病(AML)的誘導治療已經大體保持不變近50年并且AML仍然是預后不良的疾病。急性骨髓性白血病(AML)是其特征為在骨髓中不成熟的骨髓細胞的快速增殖，從而導致不正常的造血功能的疾病。雖然標準的誘導化療可以誘導完全緩解，但許多患者最終復發和死于該疾病，從而要求開發針對AML的新療法。在AML細胞的免疫表型分型的最新進展已經揭示了若干AML相關的細胞表面抗原，其可以作為用于未來療法的靶。白細胞介素3受體α鏈(IL-3Rα；CD123–NCBI參考：NP_001254642)已被確定為潛在的免疫治療靶，因為，與正常造血干細胞相比，它在AML腫瘤細胞上過表達。另外，已經完成對于CD123特異性療法的兩個I期臨床試驗，其中兩種藥物均顯示良好的安全性曲線(ClinicalTrials.gov ID:NCT00401739和NCT00397579)。不幸的是，這些CD123靶向藥物具有有限的功效，表明需要替代的并且更有效和特異性的靶向CD123的療法來觀察到抗白血病活性。用于治療白血病的可能更有效的替代療法可以是使用表達以MHC非依賴性方式針對細胞表面腫瘤相關抗原(TAA)重新定向T細胞特異性的嵌合抗原受體(CAR)的T細胞。已經開發了用于治療B細胞惡性腫瘤的靶向各種抗原的幾組CAR。然而，用于治療AML的CAR工程化T細胞仍然是很少的。具體地，仍然存在對于改進顯示更好的與T細胞增殖的相容性的CAR的構建的需要，以允許表達這種CAR的細胞達到顯著的臨床優勢。此外,存在改進具有增殖和選擇性地靶向表達CD123的細胞的能力的CD123 CAR的需要。進一步地，使用表達靶向CD123的免疫T細胞的這種CAR結合細胞毒性化療劑作為通常用作抗癌治療的治療仍然是問題。已開發多種細胞毒性劑如抗代謝物、烷化劑、蒽環類(anthracycline)、DNA甲基轉移酶抑制劑、鉑化合物和紡錘體毒物(spindle poison)來殺死癌細胞，特別是表達CD123的癌細胞。由于它們的非特異性毒性，這些化療劑可能不利于強健的抗腫瘤免疫活性T細胞的建立。靶向細胞增殖途徑的基于小分子的療法也可能妨礙抗腫瘤免疫性的建立。因此，還存在開發具有特異性并與藥物，特別是抗癌化療劑，如影響細胞增殖的那些的使用相容的靶向CD123的T細胞的需要。因此，為了連同化療一起來使用“現成的(off-the shelf)”異基因(allogeneic)治療性細胞，本專利技術人開發了將異基因T細胞工程化為較少異源性且耐化療劑的方法。此策略提供的治療益處可以由化療和免疫療法之間的協同效應而強化。此外，耐藥性還可以受益于選擇性地擴增工程化T細胞的能力從而避免由低效率的基因轉移到這些細胞所引起的問題。
技術實現思路
本專利技術人已經生成了CD123特異性CAR，其具有不同的設計并且包含源自CD123特異性抗體的不同的scFv。這些CD123特異性CAR被無差別地指定為CD123特異性CAR或抗CD123 CAR、或123CAR、或“本專利技術的CAR”。具體地，本專利技術人已經開發了CD123特異性CAR，其包含源自具有不同結構的Klon43的scFV，以及確定高度特異性的和非常有選擇性的CAR結構，其結合于表達CD123的細胞并選擇性地破壞表達CD123的癌細胞。在體外非特異性活化(例如，用抗CD3/CD28涂覆珠和重組IL2)之后，使用病毒轉導用表達這些CAR的多核苷酸轉化來自供體的T細胞。在某些情況下，進一步工程化T細胞以產生非同種異體反應性(non-alloreactive)T細胞，更具體地通過破壞(disruption)TCR(αβ–T細胞受體)的組件來防止移植物(graft)相對于宿主反應。進一步工程化T細胞以產生對抗癌藥物具有耐受性的T細胞，以結合所述經典的抗癌藥物使用。得到的工程化T細胞在不同程度上顯示出針對CD123陽性細胞的體外反應性，表明本專利技術的CAR有助于T細胞的抗原依賴性活化以及增殖，使得它們可用于免疫療法。得到的工程化T細胞顯示出針對CD123陽性細胞的體內反應性并顯著減少體內癌細胞的數目。設計本專利技術的工程化T細胞以顯示出針對CD123陽性細胞的體內反應性，可以連同抗癌藥物一起使用，并且耐受良好。在具體實施方式中，即使在多次給予以后，本專利技術的工程化T細胞仍然是有效的，使得它們可以作為第一治療(誘導(induction))、作為鞏固(consolidation)治療、作為與經典的抗癌化療結合的治療用于免疫療法。在本說明書中詳細說明編碼本專利技術的CAR的多肽和多核苷酸序列。本專利技術的工程化免疫細胞特別可用于治療應用，如B細胞淋巴瘤或白血病治療。附圖說明圖1：根據本專利技術的工程化免疫細胞的示意圖。在此圖中呈現的工程化免疫細胞是用編碼CAR的逆轉錄病毒多肽轉導的T細胞。進一步工程化這種T細胞以允許更好和更安全地植入患者，其在本專利技術的框架內是可選的。X基因可以是例如表達TCR的組件(TCRα或TCRβ)的基因，Y可以是涉及T細胞對于免疫抑制藥本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，具有選自如圖2中示出的V1、V3和V5的多肽結構的一種，所述結構包含含有來自單克隆抗CD123抗體的VH和VL的胞外配體結合結構域、鉸鏈、跨膜結構域、包括CD3ζ信號結構域和來自4?1BB的共刺激結構域的胞質結構域，所述123CAR具有與SEQ?ID?NO.42、SEQ?ID?NO.44或SEQ?ID?NO.46至少80％的序列一致性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.03.19 DK PA2014701371.一種CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，具有選自如圖2中示出的V1、V3和V5的多肽結構的一種，所述結構包含含有來自單克隆抗CD123抗體的VH和VL的胞外配體結合結構域、鉸鏈、跨膜結構域、包括CD3ζ信號結構域和來自4-1BB的共刺激結構域的胞質結構域，所述123CAR具有與SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.46至少80％的序列一致性。2.根據權利要求1所述的具有如圖2所示的多肽結構V3的CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，其中，所述123CAR具有與SEQ ID N NO.44至少80％的序列一致性。3.根據權利要求1或2所述的具有如圖2所示的多肽結構V3的CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，所述結構包含來自單克隆抗CD123抗體的胞外配體結合結構域VH和VL，所述單克隆抗CD123抗體包含以下CDR序列：GFTFTDYY(SEQ ID NO.67)、RSKADGYTT(SEQ ID NO.68)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(SEQ ID NO.69)、和QNVDSA(SEQ ID NO.70)、SAS(SEQ ID NO.71)、QQYYSTPWT(SEQ ID NO.72)，并且所述結構包含：鉸鏈、跨膜結構域和包括CD3ζ信號結構域和來自4-1BB的共刺激結構域的胞質結構域。4.根據權利要求1至3中任一項所述的CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，其中，所述胞外配體結合結構域VH和VL是人源化的。5.根據權利要求1至4中任一項所述的CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，其中，所述來自單克隆抗CD123抗體的胞外配體結合結構域VH和VL包含以下序列：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGFTFTDYYXXXXXXXXXXXXXXXXXIRSKADGYTTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXARDAAYYSYYSPEGAMDYXXXXXXXXXXX(SEQ ID N°73)和/或XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQNVDSAXXXXXXXXXXXXXXXXXSASXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQQYYSTPWTXXXXXXXXX(SEQ ID N°74)，其中X是氨基酸。6.根據權利要求1至5中任一項所述的CD123特異性嵌合抗原受體(123CAR)，其中，所述來自單克隆抗CD123抗體的胞外配體結合結構域VH和VL包含以下序列的至少一種：(變體VH1：SEQ ID NO.60)：EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VH2：SEQ ID NO.61)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VH3：SEQ ID NO.62)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VH4：SEQ ID NO.63)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VH5：SEQ ID NO.64)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VH6：SEQ ID NO.65)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VH7：SEQ ID NO.66)；EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(變體VL1：SEQ ID NO.54)：MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，(變體VL2：SEQ ID NO.55)：MADYKDIQMTQSPSSVS...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅曼·加萊托，
申請(專利權)人：塞勒克提斯公司，
類型：發明
國別省市：法國;FR