本發明專利技術公開了一種GmEF1?α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下穩定表達的內參基因的應用。本發明專利技術采用GmEF1?α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下的內參基因，通過熒光定量PCR技術檢測表明，其在秦艽根受到銀離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨的處理下可作為分析基因表達時穩定的內參使用，為研究秦艽的功能基因以及次生代謝產物——龍膽苦苷代謝途徑的關鍵酶基因的表達奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學
，具體涉及GmEF1-α2基因片段作為中藥秦艽根在不同誘導子處理條件下穩定表達的內參基因的應用。
技術介紹
中藥秦艽是我國傳統名貴中藥材，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、和血舒筋、利尿等功效。隨著社會發展，市場需求的逐年增大，以及亂采亂挖等原因，致使野生的秦艽資源遭到極大破壞。自1987年起，秦艽就被我國列為三級重點保護野生藥材。秦艽的有效成分主要是以龍膽苦苷(gentiopicroside)為代表的裂環環烯醚萜苷類(Secoiridiod glycosides)，還包括獐牙菜苦苷(swertiamarin)、獐牙菜苷(sweroside)等。這些次生代謝產物有著廣泛的生物藥理性活性，例如健胃、利膽、抗炎、抗真菌、抗組胺等。植物常常會對誘導子處理產生不同程度的響應，對中藥秦艽而言，可體現在次生代謝產物的含量升高或降低，了解誘導子處理后代謝途徑關鍵酶基因的表達，可為生產實際應用中優化龍膽苦苷等裂環環烯醚萜苷類的代謝途徑，產生更多有效的次生代謝產物提供思路。目前秦艽轉錄組數據庫的建立，為挖掘該種中藥材的基因研究提供了大量的數據資源。研究基因的表達有多種方法，而熒光實時定量PCR(RT-qPCR)因為其快速和可靠地定量分析基因表達研究而被廣泛應用。但是，實時熒光定量PCR檢測的準確性很大程度上依賴于篩選適合的內參基因對目標基因的表達數據進行校正和標準化。所謂內參基因(Endogenous references gene)即內部參照，主要作為檢測目的基因在特定條件下表達水平變化的參照物，相當于衡量基因表達的一個“標尺”。常用的內參基因應該在生物體各類細胞中均有表達，它們是在維持細胞基本生命活動中時刻表達的基因，自身表達相對穩定，不會隨著實驗材料不同而有較大差異，這樣作為一個“標尺”才可靠。然而越來越多的實驗研究發現，一些常用的內參基因并不是在所有的情況下均穩定表達，在特定的實驗條件下，內參基因的表達會發生變化。因此，在選擇使用某一個內參基因時，應首先驗證其在特定的條件下是否能夠持續穩定的表達。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供GmEF1-α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下穩定表達的內參基因的應用，所述GmEF1-α2基因片段的核苷酸序列為ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTC。采用上述GmEF1-α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下穩定表達的內參基因時，使用的特異性引物為：GmEF1-α2-F：5′-ACGAGGCTCTACAGGAGG-3′；和GmEF1-α2-R：5′-GACAGGAGCATAGCCATTG-3′。上述GmEF1-α2基因片段由下述方法克隆得到：(1)從秦艽中提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA；(2)根據轉錄組數據庫中GmEF1-α2基因的核苷酸序列：TTCTGATAAGCCCTTGCGTCTTCCACTCCAGGATGTCTACAAGATTGGTGGTATCGGTACTGTCCCAGTGGGTAGAGTCGAGACAGGTGTTCTAAAGCCCGGTATGGTAGTCACCTTTGCCCCAAGTGGACTAACGACTGAAGTGAAGTCCGTAGAGATGCATCACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTCCTGGACTGTCACACGTGCCATATCGCCGTCAAGTTTGCTGAGCTAGTGACAAAGATCGATAGACGATCTGGGAAAGAACTCGAGAAGGAACCAAAGTTCTTAAAGAACGGTGATGCCGGCATCGTGAAGATGATTCCTACTAAACCAATGGTTGTTGAGACCTTCTCTGAGTACCCACCCCTTGGAAGATTCGCCGTCAGGGACATGCGGCAGACCGTTGCTGTCGGCGTCATCAAGAGCGTTGAGAAGAAGGATCCATCTGGAGCTAAGTTGACCAAGTCTGCAGTTAAAAAAGTTGGGAAGTGATTGGCACTATCATTTAGTTGTTATTGCATTGTGTACAGGTTATAGTTTTAGTTCCCAGAATATTGGGTCTTAGGCTTAGACCTGTATTGTTTTGTGTCCTTCCTTTTCATTTTTCGCATTTTAGTATTCAGGTTCATCAGCATGTTTCCTTTGGGATCATTTTTAAATAAATAAACTTTCATTTTATCGTTATAATGTC設計合成特異性引物：GmEF1-α2-F：5′-ACGAGGCTCTACAGGAGG-3′；和GmEF1-α2-R：5′-GACAGGAGCATAGCCATTG-3′；(3)以cDNA為模板，利用步驟(2)中的特異性引物，PCR擴增GmEF1-α2基因片段，所述PCR擴增的反應條件為：98℃10s、57℃3s、72℃1min，30個循環，72℃延長10min；(4)電泳檢測步驟(3)所得PCR擴增產物，回收并純化目的片段，進行測序；(5)測序所得的序列分別通過NCBI上BLAST比對和BioEdit本地轉錄組數據庫中分析比較，進而確定所得核苷酸序列為上述GmEF1-α2基因片段。本專利技術采用GmEF1-α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下的內參基因，以熒光定量PCR技術，通過絕對定量和相對定量分析方法檢測目的基因GmSLS在秦艽根受銀離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨處理后，兩種分析方法所體現的表達結果趨勢一致，表明GmEF1-α2基因片段可以作為秦艽根在不同誘導子處理條件下的內參基因，為研究秦艽功能基因的表達奠定了基礎。附圖說明圖1是GmEF1-α2基因片段的溶解曲線。圖2是GmSLS基因片段的溶解曲線。圖3是Ct隨GmSLS基因片段濃度對數變化的標準曲線。圖4是以GmEF1-α2基因片段為內參基因分析GmSLS基因片段在秦艽根受到不同誘導子處理后的相對表達量柱狀圖。圖5是GmSLS基因片段在秦艽根受到不同誘導子處理后的絕對表達量柱狀圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本專利技術進一步詳細說明，但本專利技術的保護范圍不僅限于這些實施例。實施例1以GmEF1-α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下的內參基因，GmSLS基因片段(核苷酸序列為：CACATTCACCATACCATCCAGAAATATGGGAATAAATCATTTA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
GmEF1?α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下穩定表達的內參基因的應用，所述GmEF1?α2基因片段的核苷酸序列為ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTC。
【技術特征摘要】
1.GmEF1-α2基因片段作為秦艽根在不同誘導子處理條件下穩定表達的內參基因的應用，所述GmEF1-α2基因片段的核苷酸序列為ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTC。2.根據權利要求1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王喆之，何懿菡，宋雙紅，李燾，
申請(專利權)人：陜西師范大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61
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