利用不同檢測溫度的靶核酸序列檢測制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及利用不同檢測溫度的靶核酸序列檢測。在利用不同檢測溫度的本發(fā)明專利技術(shù)中，在1個(gè)反應(yīng)容器中僅用單一類型的標(biāo)記以現(xiàn)有的實(shí)施方式也可檢測多個(gè)靶核酸序列。在現(xiàn)有技術(shù)中，在靶擴(kuò)增后通過解鏈分析檢測多個(gè)靶核酸序列。與此不同地，本發(fā)明專利技術(shù)在靶擴(kuò)增后無需進(jìn)行解鏈分析，從而顯著縮短分析時(shí)間。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及利用不同檢測溫度的靶核酸序列檢測。
技術(shù)介紹
為了檢測靶核酸序列，廣泛利用以實(shí)時(shí)方式一邊監(jiān)控靶擴(kuò)增，一邊可檢測靶核酸序列的實(shí)時(shí)檢測方法。通常，在實(shí)時(shí)檢測方法中利用與靶核酸序列特異性雜交的已標(biāo)記的探針或引物。作為利用已標(biāo)記的探針及靶核酸序列之間的雜交的方法的例，包括利用具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙重標(biāo)記的探針的分子信標(biāo)(Molecular beacon)方法(Tyagi等，Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996)、HyBeacon方法(French DJ等，Mol.Cell Probes,15(6):363-374(2001)、利用2個(gè)分別標(biāo)記成供體(donor)及受體(acceptor)的2個(gè)探針的雜交探針方法(Bernad等，147-148 Clin Chem 2000；46)及利用單一標(biāo)記的寡核苷酸的Lux方法(美國專利第7537886號(hào))。在本
中廣泛利用TaqMan方法(美國專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))，上述TaqMan方法(美國專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))利用借助雙重標(biāo)記的探針和脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探針的切割。作為利用標(biāo)記的引物的方法的例，包括日出(Sunrise)引物方法(Nazarenko等，2516-2521 Nucleic Acids Research,1997,v.25no.12及美國專利第6117635號(hào))及蝎形(Scorpion)引物方法(Whitcombe等，804-807,Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999及美國專利第6326145號(hào))及TSG引物方法(WO 2011-078441)。作為代替接近法，提出利用以依賴于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚物的實(shí)時(shí)檢測方法，例如，侵入物(Invader)分析(美國專利第5691142號(hào)、美國專利第6358691號(hào)及美國專利第6194149號(hào))、探測和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage and extension；PTOCE)方法(WO 2012/096523)、探測和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization；PCE-SH)方法(WO 2013/115442)及探測和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization；PCE-NH)方法(PCT/KR2013/012312)。如上所述的現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測技術(shù)在與靶擴(kuò)增相相關(guān)或無關(guān)的信號(hào)擴(kuò)增過程中，在1個(gè)所選擇的檢測溫度下檢測從熒光標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中利用單一類型的標(biāo)記來檢測多個(gè)靶核酸序列時(shí)，互不區(qū)別針對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的多個(gè)信號(hào)。因此，為了檢測多個(gè)靶核酸序列，在現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測技術(shù)中一般利用不同類型的標(biāo)記。在利用單一類型的標(biāo)記的情況下，利用Tm差異的解鏈分析可檢測多個(gè)靶核酸序列，但是，解鏈分析具有如下缺點(diǎn)：解鏈分析的進(jìn)行時(shí)間長于實(shí)時(shí)技術(shù)進(jìn)行時(shí)間，且隨著靶核酸序列的增加，使具有不同的Tm值的探針的設(shè)計(jì)變得越來越難。因此，若開發(fā)不依賴于解鏈分析且在1個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)記及單一類型的檢測器來檢測靶核酸序列的新方法或接近法，則能夠以便利性、費(fèi)用效果及效率性大大提高的方式檢測多個(gè)靶核酸序列。并且，若結(jié)合上述新方法與其他檢測方法(例如，解鏈分析)，則能夠以效率大大提高的方式在1個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)記檢測多個(gè)靶核酸序列。在本說明書全文中，參照了多篇專利及文獻(xiàn)，并用括號(hào)表示了其引用。為了更加明確地說明本專利技術(shù)及本專利技術(shù)所屬
的水平，這種專利及文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全插入于本說明書作為參照。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)人為了開發(fā)在1個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)記及單一類型的檢測器來檢測多個(gè)靶核酸序列的新方法而進(jìn)行了努力研究。研究結(jié)果，本專利技術(shù)人在調(diào)節(jié)的檢測溫度下獲得針對(duì)靶核酸序列的信號(hào)后，通過合適地分析檢測結(jié)果確認(rèn)到能夠以便利性、費(fèi)用效果及效率性大大提高的方式在1個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)記及單一類型的檢測器檢測多個(gè)靶核酸序列。因此，本專利技術(shù)的目的在于，提供利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法及試劑盒。本專利技術(shù)的再一目的在于，提供利用不同檢測溫度來對(duì)試樣內(nèi)核酸序列的核苷酸多態(tài)性(SNP)基因型進(jìn)行分析的方法及試劑盒。本專利技術(shù)的還一目的在于，提供利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法及試劑盒。本專利技術(shù)的另一目的在于，提供利用不同檢測溫度及解鏈分析檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法及試劑盒。本專利技術(shù)的又一目的在于，提供利用檢測溫度分析及解鏈分析檢測至少3個(gè)靶核酸序列的方法及試劑盒。本專利技術(shù)的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指示，上述處理器用于利用不同檢測溫度確定試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的存在的方法。本專利技術(shù)的又一目的在于，提供利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)靶核酸序列的裝置。本專利技術(shù)的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于確定試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的存在的方法的處理器且存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。本專利技術(shù)的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指示，上述處理器用于利用不同檢測溫度確定試樣內(nèi)3個(gè)靶核酸序列的存在的方法。與所附的專利技術(shù)要求保護(hù)范圍及附圖一同，通過以下詳細(xì)說明可使本專利技術(shù)的其他目的及優(yōu)點(diǎn)更加明確。附圖說明圖1a為示出為了檢測具有相對(duì)較高檢測溫度(72℃)的靶核酸序列(沙眼衣原體(CT，Chlamydia trachomatis)的基因組脫氧核糖核酸)、具有相對(duì)較低檢測溫度(60℃)的靶核酸序列(淋球菌(NG，Neisseria gonorrhoeae)基因組脫氧核糖核酸)及它們的組合而利用不同檢測溫度的本專利技術(shù)的檢測結(jié)果的圖。通過探測和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法產(chǎn)生針對(duì)上述沙眼衣原體及淋球菌的信號(hào)。圖1b為示出通過相對(duì)較高檢測溫度下的信號(hào)及相對(duì)較低檢測溫度下的信號(hào)之間的比率確定具有相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在的圖。圖1c為示出通過對(duì)相對(duì)較高檢測溫度下的信號(hào)及相對(duì)較低檢測溫度下的信號(hào)之間的比率進(jìn)行浮動(dòng)來確定具有相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在的圖。圖1d及圖1e為示出通過相對(duì)較高檢測溫度下的信號(hào)及相對(duì)較低檢測溫度下的信號(hào)之間的差異確定具有相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在的圖，將上述相對(duì)較高檢測溫度下的信號(hào)變形成閾值且用于獲得上述差異。圖2a為示出為了檢測具有相對(duì)較高檢測溫度(72℃)的靶核酸序列(沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸)、具有相對(duì)較低檢測溫度(60℃)的靶核酸序列(淋球菌基因組脫氧核糖核酸)及它們的組合而利用不同檢測溫度的本專利技術(shù)的檢測結(jié)果的圖。通過TaqMan實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法產(chǎn)生針對(duì)上述沙眼衣原體的信號(hào)，通過探測和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法產(chǎn)生針對(duì)上述淋球菌的信號(hào)。圖2b為示出通過相對(duì)較高檢測溫度下的信號(hào)及相對(duì)較低檢測溫度下的信號(hào)之間的比率確定具有本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步驟(a)，在1個(gè)反應(yīng)容器中與用于檢測上述2個(gè)靶核酸序列的信號(hào)?產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)上述試樣，并利用單一類型的檢測器檢測所產(chǎn)生的信號(hào)，借助相應(yīng)的信號(hào)?產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測各個(gè)上述靶核酸序列，上述2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)具有借助相應(yīng)的上述信號(hào)?產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較高的檢測溫度，另一個(gè)具有借助相應(yīng)的上述信號(hào)?產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較低檢測溫度，上述相對(duì)較高檢測溫度為能夠產(chǎn)生針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)的溫度，上述相對(duì)較低檢測溫度為能夠產(chǎn)生針對(duì)具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)以及針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)的溫度，由上述2個(gè)信號(hào)?產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被上述單一類型的檢測器區(qū)別，在上述相對(duì)較高檢測溫度以及上述相對(duì)較低檢測溫度下均進(jìn)行上述檢測；以及步驟(b)，根據(jù)在上述步驟(a)中檢測出的信號(hào)確定2個(gè)靶核酸序列的存在，(i)根據(jù)在上述相對(duì)較高檢測溫度下檢測出的信號(hào)確定具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的存在，(ii)根據(jù)在上述相對(duì)較高檢測溫度檢測出的信號(hào)以及在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)之間的差異確定具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在。...

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.03.28 KR 10-2014-0037310;2014.05.09 KR PCT/KR1.一種利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步驟(a)，在1個(gè)反應(yīng)容器中與用于檢測上述2個(gè)靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)上述試樣，并利用單一類型的檢測器檢測所產(chǎn)生的信號(hào)，借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測各個(gè)上述靶核酸序列，上述2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)具有借助相應(yīng)的上述信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較高的檢測溫度，另一個(gè)具有借助相應(yīng)的上述信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較低檢測溫度，上述相對(duì)較高檢測溫度為能夠產(chǎn)生針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)的溫度，上述相對(duì)較低檢測溫度為能夠產(chǎn)生針對(duì)具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)以及針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)的溫度，由上述2個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被上述單一類型的檢測器區(qū)別，在上述相對(duì)較高檢測溫度以及上述相對(duì)較低檢測溫度下均進(jìn)行上述檢測；以及步驟(b)，根據(jù)在上述步驟(a)中檢測出的信號(hào)確定2個(gè)靶核酸序列的存在，(i)根據(jù)在上述相對(duì)較高檢測溫度下檢測出的信號(hào)確定具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的存在，(ii)根據(jù)在上述相對(duì)較高檢測溫度檢測出的信號(hào)以及在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)之間的差異確定具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在伴隨核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行上述步驟(a)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在無核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行上述步驟(a)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)各個(gè)上述靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于二聚物形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)各個(gè)上述靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為利用以依賴于與上述靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為基于檢測寡核苷酸的切割的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，針對(duì)具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為基于二聚物形成的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為基于檢測寡核苷酸的切割的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，針對(duì)具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為利用以依賴于與上述靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述2個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含相同的標(biāo)記，從上述標(biāo)記的信號(hào)不被單一類型的檢測器區(qū)別。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述差異包含對(duì)在上述相對(duì)較高檢測溫度下檢測出的信號(hào)以及在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來獲得的差異。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在上述相對(duì)較高檢測溫度下未檢測出信號(hào)的情況下，考慮到在上述相對(duì)較高檢測溫度下未檢測出信號(hào)，根據(jù)在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)確定具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列存在的情況下，在上述利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法中，為了確定具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在而利用基準(zhǔn)值。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，為了確定具有上述相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在，在上述利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法中利用基準(zhǔn)值，(i)在與上述步驟(a)中的反應(yīng)容器不同的其他反應(yīng)容器中與用于檢測具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的靶核酸序列，(ii)在上述相對(duì)較高檢測溫度以及上述相對(duì)較低檢測溫度下均檢測信號(hào)之后，(iii)通過求出在上述相對(duì)較高檢測溫度下檢測出的信號(hào)以及在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)之間的差異來獲得上述基準(zhǔn)值。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述1個(gè)反應(yīng)容器還包括至少1個(gè)附加裝置，上述至少1個(gè)附加裝置分別包括用于檢測除了上述2個(gè)靶核酸序列之外的靶核酸序列的額外的2個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，在上述容器相互區(qū)別由2個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的各個(gè)裝置產(chǎn)生的上述信號(hào)，借助不同類型的檢測器分別檢測上述信號(hào)。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述2個(gè)靶核酸序列包含核苷酸變異，上述2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)包含上述核苷酸變異中的一種類型，另一個(gè)包含核苷酸變異中的另一類型。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述核苷酸變異為單核苷酸多態(tài)性。16.一種利用不同檢測溫度分析試樣內(nèi)核酸序列的核苷酸多態(tài)性基因型的方法，其特征在于，包括：步驟(a)，在1個(gè)反應(yīng)容器中與用于檢測核苷酸多態(tài)性等位基因的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)包含含有上述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核算序列的試樣，并利用單一類型的檢測器檢測所產(chǎn)生的信號(hào)，借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測各個(gè)上述核苷酸多態(tài)性等位基因，上述核苷酸多態(tài)性等位基因中的一個(gè)具有借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較高檢測溫度，另一個(gè)具有借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較低檢測溫度，上述相對(duì)較高檢測溫度為能夠產(chǎn)生針對(duì)具有上述相對(duì)較高檢測溫度的核苷酸多態(tài)性等位基因的信號(hào)的溫度，上述相對(duì)較低檢測溫度為能夠產(chǎn)生針對(duì)具有上述相對(duì)較低檢測溫度的核苷酸多態(tài)性等位基因的信號(hào)以及針具有上述相對(duì)較高檢測溫度的核苷酸多態(tài)性等位基因的信號(hào)的溫度，由上述信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被上述單一類型的檢測器區(qū)別，在上述相對(duì)較高檢測溫度以及上述相對(duì)較低檢測溫度下均進(jìn)行上述檢測；以及步驟(b)，根據(jù)上述步驟(a)中的在上述相對(duì)較高檢測溫度下檢測出的信號(hào)以及在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)之間的差異確定核苷酸多態(tài)性基因型。17.一種利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步驟(a)，在1個(gè)反應(yīng)容器中與用于檢測上述至少3個(gè)靶核酸序列的至少3個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)上述試樣，并利用單一類型的檢測器檢測所產(chǎn)生的信號(hào)，借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)分別檢測上述至少3個(gè)靶核酸序列，上述至少3個(gè)靶核酸序列分別具有借助相應(yīng)的上述信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的不同檢測溫度，上述檢測溫度為不僅能夠產(chǎn)生具有上述檢測溫度的靶核酸序列且還能夠產(chǎn)生針對(duì)具有高于上述檢測溫度的檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)的溫度，由上述信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被上述單一類型的檢測器區(qū)別，在各個(gè)不同檢測溫度下進(jìn)行上述檢測；以及步驟(b)，根據(jù)在上述步驟(a)中檢測出的信號(hào)確定至少3個(gè)靶核酸序列的存在，當(dāng)確定具有上述至少3個(gè)靶核酸序列中的特定檢測溫度的靶核酸序列的存在時(shí)，根據(jù)在高于上述特定檢測溫度的1個(gè)以上的檢測溫度下檢測出的信號(hào)以及在上述特定檢測溫度下檢測出的信號(hào)之間的差異確定具有上述特定檢測溫度的靶核酸序列的存在，在上述檢測溫度中上述特定檢測溫度為相對(duì)最高檢測溫度時(shí)，根據(jù)在上述特定檢測溫度下檢測出的信號(hào)確定上述靶核酸序列的存在。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，首先確定具有相對(duì)最高檢測溫度的靶核酸序列的存在后，以按降序排列依次確定具有相對(duì)較低檢測溫度的靶核酸序列的存在的方式進(jìn)行上述步驟(b)。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在伴隨核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行上述步驟(a)。20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在無核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行上述步驟(a)。21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)各個(gè)上述靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于二聚物形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)各個(gè)上述靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為利用以依賴于與上述靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)具有上述相對(duì)最高檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為基于檢測寡核苷酸的切割的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，針對(duì)剩余上述靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為基于二聚物形成的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，針對(duì)具有上述相對(duì)最高溫檢測溫度的靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為基于檢測寡核苷酸的切割的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，對(duì)剩余上述靶核酸序列的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為利用以依賴于與上述靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述至少3個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含相同的標(biāo)記，從上述標(biāo)記的信號(hào)不被單一類型的檢測器區(qū)別。26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述差異包含對(duì)在高于上述特定檢測溫度的1個(gè)以上的檢測溫度下檢測出的信號(hào)以及在上述相對(duì)較低檢測溫度下檢測出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來獲得的差異。27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，在高于上述特定檢測溫度的檢測溫度下未檢測出信號(hào)的情況下，考慮到在高于上述特定檢測溫度的檢測溫度下未檢測出信號(hào)，根據(jù)在上述特定檢測溫度下檢測出的信號(hào)確定具有上述特定檢測溫度的靶核酸序列的存在。28.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，當(dāng)具有高于上述特定加測溫度的檢測溫度的靶核酸序列存在時(shí)，在上述利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法中，為了確定具有上述特定檢測溫度的靶核酸序列的存在而利用至少1個(gè)基準(zhǔn)值。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，為了確定具有上述特定檢測溫度的靶核酸序列的存在，在上述利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法中利用上述基準(zhǔn)值中的至少1個(gè)基準(zhǔn)值，(i)在與上述步驟(a)中的反應(yīng)容器不同的其他反應(yīng)容器中與相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)具有高于上述特定檢測溫度的檢測溫度的靶核酸序列的所有組合，(ii)在高于上述特定檢測溫度的1個(gè)以上的檢測溫度以及上述特定檢測溫度下檢測信號(hào)后，(iii)通過求出在高于上述特定檢測溫度的1個(gè)以上的檢測溫度下檢測出的信號(hào)以及在上述特定檢測溫度下檢測出的信號(hào)之間的差異來獲得上述基準(zhǔn)值。30.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述1個(gè)反應(yīng)容器還包括至少1個(gè)附加裝置，上述至少1個(gè)附加裝置分別包括用于檢測除了上述3個(gè)靶核酸序列之外的靶核酸序列的額外的3個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，在上述容器中相互區(qū)別由至少3個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的個(gè)裝置產(chǎn)生的上述信號(hào)，借助不同類型的檢測器分別檢測上述信號(hào)。31.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用不同檢測溫度檢測試樣內(nèi)至少3個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。32.一種利用不同檢測溫度及解鏈分析檢測試樣內(nèi)2個(gè)靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步驟(a)，在1個(gè)反應(yīng)容器中與用于檢測上述2個(gè)靶核酸序列的2個(gè)信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)上述試樣，并利用單一類型的檢測器檢測所產(chǎn)生的信號(hào)，借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測各個(gè)上述靶核酸序列，上述2個(gè)靶核酸序列的一個(gè)具有借助相應(yīng)的信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較高檢測溫度，另一個(gè)具有借助相應(yīng)的上述信號(hào)-產(chǎn)生機(jī)構(gòu)確定的相對(duì)較低檢測溫度，上述...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：千鐘潤，李榮祚，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：SEEGENE株式會(huì)社，
類型：發(fā)明
國別省市：韓國;KR