本發明專利技術公開了一種一步均相SAA檢測試劑盒，主要組成包括：抗SAA抗體偶聯的發光微球、抗SAA抗體偶聯的感光微球、分析緩沖液、反應孔；本發明專利技術還公開了所述一步均相SAA檢測試劑盒的制備方法，該方法包括：抗SAA抗體偶聯發光微球的制備；抗SAA抗體偶聯感光微球的制備，以及分析緩沖液的制備；最后本發明專利技術公開了一步均相SAA檢測試劑盒的使用方法；本發明專利技術的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、檢測范圍寬、重復性好，操作簡單，免清洗等特點，將其應用于感染的監測，可以提高炎癥診斷的準確率，便于臨床檢測使用，具有極大的市場價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及SAA含量檢測領域，具體涉及一種一步均相SAA檢測試劑盒及其制備和使用方法。
技術介紹
血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)是一種急性時相反應蛋白，屬于載脂蛋白家族中的異質類蛋白質，相對分子量約為12 000。SAA基因具有4個外顯子，3個內含子，長約3.20kb，與其他大多數載脂蛋白的基因一樣。目前已發現的4種人SAA基因均位于11號染色體上。SAA1和SAA2屬急性期基因，編碼急性期蛋白(A-SAA)；SAA3是假基因；SAA4是結構基因，編碼結構蛋白。SAA是一種高度特異性的蛋白質，成熟SAA由104個氨基酸構成，其N端的11個氨基酸是脂質結合部位，其前端76個氨基酸被酶切后可成為淀粉樣蛋白A，而其第77～104位氨基酸是中性粒細胞結合區，有免疫相關的生物學功能。在急性時相反應中，經白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、SAA和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激，肝細胞可迅速合成SAA，濃度在4-6h內達到峰值，從正常水平的1-5μg/ml升高到1000μg/ml，但半減期短，只有50min左右。PCT要在1-2d達到峰值、半減期長；CRP要在2-3d達到峰值、增幅數至數百倍、半減期最長。因此，在感染性疾病的最早期或急性期診斷中，無論是細菌、病毒還是真菌感染，SAA的靈敏度都要優于PCT和CRP；尤其是對于病毒性感染的診斷和鑒別診斷來說，SAA更具優勢。SAA在病毒和細菌感染中均升高，而病毒感染中CRP幾乎不升高或升高不明顯。對于微弱的炎癥刺激，SAA較CRP更靈敏。因此，在CRP正常的病毒感染患者、非侵襲性或早期侵襲性細菌感染患者中，SAA是一個較為有用的指標。在小兒感染性疾病早期，由于小兒患者的體征和癥狀均不明確，很難鑒別是細菌感染還是病毒感染。所以早期快速地鑒別小兒患者細菌感染和病毒感染，對于及時有效地治療及各種并發癥的預防有著重要的意義。病毒感染時PCT水平稍增高，CRP幾乎不升高或升高不明顯，而SAA則明顯升高，且病毒感染組SAA/CRP比值明顯高于細菌感染組，提示病毒感染時，血清SAA變化較CRP、PCT更為敏感，因此血SAA水平和SAA/CRP比值可作為診斷病毒感染、鑒別細菌和病毒感染的敏感指標。另外，SAA和CRP的比值與小兒感染性疾病的嚴重程度存在相關性，監測SAA/CRP比值比單獨檢測SAA或CRP具有更大的應用價值。目前用于檢測SAA的方法主要是放射性免疫檢測法(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、乳膠免疫比濁法等。RIA有很高的檢測靈敏度，但由于標記物具有放射性危害，標記物穩定性差，廢棄物難以處理等缺點，已逐漸退出臨床檢驗領域。ELISA法采用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或堿性磷酸酶標記抗體，并催化底物產生顏色變化，具有操作簡單，試劑穩定期長的特點，但ELISA法的檢測靈敏度較低，線性范圍窄，目前主要應用于傳染性疾病篩查等對檢測靈敏度要求較低的項目。乳膠免疫比濁法是利用抗原抗體反應原理測定血清中SAA的含量，此方法無法兼顧靈敏度和線性。
技術實現思路
專利技術目的：針對現有SAA免疫檢測方法存在的問題，本專利技術提供一種可用于定量檢測的一步均相SAA檢測試劑盒；本專利技術還提供一種一步均相SAA檢測試劑盒的制備方法和使用方法。技術方案：為了實現上述目的，如本專利技術所述一種一步均相SAA檢測試劑盒，主要組成包括：抗SAA抗體偶聯的發光微球、抗SAA抗體偶聯的感光微球、分析緩沖液、反應孔。所述發光微球表面活性基團為醛基、羧基、氨基等，發光微球帶有發光化合物和鑭系元素化合物的高分子，發光化合物可以是Dioxene(二氧雜環己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，發光微球大小為100-300nm，該發光微球可由鉑金埃爾默公司購得。所述感光微球表面活性基團為醛基、羧基、氨基等，感光微球帶有光激發產生單線態氧的染料，如酞箐染料、葉綠素等，感光微球大小為100-300nm，該感光微球可由鉑金埃爾默公司購得。進一步地，所述抗SAA抗體(通過常規免疫學方法制備)為針對SAA不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體。進一步地，所述反應孔為微孔板、微流控試劑盤、反應杯或反應管。本專利技術所述的一步均相SAA檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：(1)抗SAA抗體偶聯發光微球的制備；(2)抗SAA抗體偶聯感光微球的制備；(3)分析緩沖液的制備。進一步地，所述抗SAA抗體偶聯發光微球的制備，包括如下步驟：(1)將抗SAA抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將發光微球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；(2)將抗體溶液加入到發光微球中，重懸；(3)加入2.0-3.0μl 10％質量分數Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES緩沖液將體積補足到200μl，震蕩反應24-48小時；(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反應體系中；震蕩反應0.5-1.5小時，離心，去除上清；(5)加入150-250μl Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復一次；(6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需濃度。進一步地，所述抗SAA抗體偶聯感光微球的制備，包括如下步驟：(1)將抗SAA抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將感光微球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；(2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；(3)加入2.0-3.0μl 10％質量分數Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES緩沖液將體積補足到200μl，震蕩反應24-48小時；(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反應體系中；震蕩反應0.5-1.5小時，離心，去除上清；(5)加入150-250μl Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復一次；(6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需濃度。進一步地，所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟：將HEPES 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸餾水溶解后，制成分析緩沖液。進一步地，步驟(1)中所述抗SAA抗體與發光微球與的質量比為1：(1-100)。進一步地，步驟(1)所述抗SAA抗體與感光微球的質量比為1：(1-100)。進一步地，使用分析緩沖液稀釋抗SAA抗體偶聯的發光微球濃度為10-200μg/ml；稀釋抗SAA抗體偶聯的感光微球濃度為10-200μg/ml。本專利技術所述的一步均相SAA檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：(1)在試劑盒的反應孔中加入樣品、抗SAA抗體偶聯的發光微球和抗SAA抗體偶聯的感光微球，混合反應5-60分鐘；(2)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光量獲得光信號值；(3)繪制SAA濃度與光信號值的標準曲線，利用步本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種一步均相SAA檢測試劑盒，其特征在于，主要組成包括：抗SAA抗體偶聯的發光微球、抗SAA抗體偶聯的感光微球、分析緩沖液、反應孔。
【技術特征摘要】
1.一種一步均相SAA檢測試劑盒，其特征在于，主要組成包括：抗SAA抗體偶聯的發光微球、抗SAA抗體偶聯的感光微球、分析緩沖液、反應孔。2.根據權利要求1所述的一步均相SAA檢測試劑盒，其特征在于，所述抗SAA抗體為針對SAA不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體。3.根據權利要求1所述的一步均相SAA檢測試劑盒，其特征在于，所述反應孔為微孔板、微流控試劑盤、反應杯或反應管。4.權利要求1-3任一所述的一步均相SAA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)抗SAA抗體偶聯發光微球的制備；(2)抗SAA抗體偶聯感光微球的制備；(3)分析緩沖液的制備。5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述抗SAA抗體偶聯發光微球的制備，包括如下步驟：(1)將抗SAA抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將發光微球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；(2)將抗體溶液加入到發光微球中，重懸；(3)加入2.0-3.0μl 10％質量分數Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES緩沖液將體積補足到200μl，震蕩反應24-48小時；(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反應體系中；震蕩反應0.5-1.5小時，離心，去除上清；(5)加入150-250μl Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復一次；(6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需濃度。6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述抗SAA抗體偶聯感光微球的制備，包括如下步驟：(1)將抗SAA抗體加入到超濾管中，離心，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李明明，黃寶福，淳林，
申請(專利權)人：南京普朗醫療設備有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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