一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝制造技術

本發明專利技術公開了一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝，首先將畢赤酵母菌種液接種到滅菌的發酵培養基中，發酵培養14～18小時后，開始補加甲醇進行誘導表達，同時向發酵培養基中加入丙酮酸鈉，其中丙酮酸鈉的加入量為0.01～10g/L。本發明專利技術在發酵過程中，選取在甲醇誘導表達階段加入丙酮酸鈉，提高了重組人源膠原蛋白的生物合成速率，并且采用連續流加的方式，能夠進一步提高重組人源膠原蛋白的生物合成速率，發酵時間縮短，同時重組人源膠原蛋白的表達量增加，發酵水平提高了20％以上，節約了生產成本，特別適用于重組人源膠原蛋白的工業化大規模生產，能夠為產業化生產帶來巨大的實際應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物發酵
，涉及一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝。
技術介紹
膠原蛋白是動物體內一類重要的蛋白質，廣泛分布于皮膚、軟骨、血管等組織，參與細胞的遷移、分化和繁殖，對維護細胞、組織、器官的正常生理功能起著重要的作用，在食品、飼料、美容、化妝品、醫藥等領域應用普遍。目前，膠原蛋白原料主要通過酸、堿、加熱等物理化學方法處理如豬、牛等動物皮膚、骨骼等組織后分離純化獲得。但是，上述方法得到的膠原蛋白成分復雜，水溶性差，并且由于來自動物組織，存在病毒隱患，限制了膠原蛋白在醫藥方面的應用。隨著DNA重組技術的迅速發展，各種宿主細胞被選為基因工程菌用于表達膠原蛋白。與傳統工藝相比，膠原蛋白的基因工程菌發酵工藝具有生產原料易得、環保、產品質量穩定等優點，但是也存在著發酵周期較長，生產效率較低等問題。中國專利201010602214.8公開了一種畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產方法，采用巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13為菌種，重組膠原蛋白表達量為5g/L，發酵周期99小時，發酵水平為0.051g/L·h，發酵周期雖短，但蛋白表達量和發酵水平過低。中國專利201110327865.5構建了一種重組人源膠原蛋白的巴氏畢赤酵母基因工程菌，基因工程菌經發酵培養得到重組人源膠原蛋白，發酵周期為136小時，蛋白表達量為16g/L，發酵水平為0.118g/L·h，蛋白表達量雖有提高，但是發酵周期過長，發酵水平較低。因此，進一步地縮短發酵時間，提高蛋白表達量，進而提高發酵水平，有利于膠原蛋白的工業化大規模生產，能夠為產業化生產帶來實際應用價值。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝，通過在發酵過程中加入0.01g/L-10g/L的丙酮酸鈉，調節畢赤酵母菌的生長代謝速度，縮短了發酵周期，提高了重組人源膠原蛋白的表達量，進一步提升了重組人源膠原蛋白的生產水平。本專利技術的技術方案如下：一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝，包括以下步驟：將畢赤酵母菌種 液接種到滅菌的發酵培養基中，發酵培養14～18小時后，開始補加甲醇進行誘導表達，同時向發酵培養基中加入丙酮酸鈉，其中丙酮酸鈉的加入量為0.01～10g/L。本專利技術所述的畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5021，并在中國專利201110327865.5中充分公開。優選地，所述的丙酮酸鈉的加入量為0.1g/L～1g/L。優選的，所述的丙酮酸鈉的加入方式為流加。本專利技術所述的畢赤酵母發酵培養基采用現有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。本專利技術的發酵工藝中，畢赤酵母菌種液的接種量為8～12％，發酵溫度為28～30℃，氨水調節pH為5.0～5.2，溶氧不低于20％，甲醇誘導時間為90～120小時。與現有技術相比，本專利技術的顯著效果如下：本專利技術在發酵過程中，選取在甲醇誘導表達階段加入丙酮酸鈉，提高了重組人源膠原蛋白的生物合成速率，并且采用連續流加的方式，能夠進一步提高重組人源膠原蛋白的生物合成速率，發酵時間縮短，同時重組人源膠原蛋白的表達量增加，發酵水平提高了20％以上，節約了生產成本，特別適用于重組人源膠原蛋白的工業化大規模生產，能夠為產業化生產帶來巨大的實際應用價值。具體實施方式在本專利技術的具體實施例中，采用的菌株為表達重組人源膠原蛋白的畢赤酵母，為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，保藏編號為CGMCC NO.5021，保藏日期為2011年6月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本專利技術所述的PTM1溶液參照Invitrogen公司的操作手冊，具體配方為：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L，用0.22μm的濾膜過濾除菌，室溫保存。下面結合實施例對本專利技術作進一步詳述。實施例1發酵培養基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。將種子液按照10％的接種量加到含有500L發酵培養基的1000L發酵罐中，初始攪拌轉速200rpm、罐壓0.05MPa，調節空氣流量和轉速使溶氧(DO)＞30％。當碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補充碳源，至菌體濕重為212g/L，停止補加甘油，此時發酵培養時間為16小時。甘油耗盡后開始流加甲醇，進入甲醇誘導培養階段，同時一次性加入丙酮酸鈉，加入量為0.01g/L發酵培養基。調節轉速、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，誘導發酵96h后，結束發酵，收集發酵液，離心獲得發酵液上清，經HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為16.0g/L，發酵周期112小時，發酵生產水平為0.143g/L·h，與對照組相比提高23.3％。實施例2發酵培養基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。將種子液按照10％的接種量加到含有500L發酵培養基的1000L發酵罐中，初始攪拌轉速200rpm、罐壓0.05MPa，調節空氣流量和轉速使溶氧(DO)＞30％。當碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補充碳源，至菌體濕重為210g/L，停止補加甘油，此時發酵培養時間為16小時。甘油耗盡后開始流加甲醇，進入甲醇誘導培養階段，同時一次性加入丙酮酸鈉，加入量為10g/L。調節轉速、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，誘導發酵96h后，結束發酵，收集發酵液，離心獲得發酵液上清，經HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為16.8g/L，發酵周期112小時，發酵生產水平為0.150g/L·h，與對照組相比提高29.3％。實施例3發酵培養基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。將種子液按照10％的接種量加到含有500L發酵培養基的1000L發酵罐中，初始攪拌轉速200rpm、罐壓0.05MPa，調節本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝，其特征在于，包括以下步驟：將畢赤酵母菌種液接種到滅菌的發酵培養基中，發酵培養14～18小時后，開始補加甲醇進行誘導表達，同時向發酵培養基中加入丙酮酸鈉，其中丙酮酸鈉的加入量為0.01～10g/L。

【技術特征摘要】
1.一種提高重組人源膠原蛋白生產水平的發酵工藝，其特征在于，包括以下步驟：將畢赤酵母菌種液接種到滅菌的發酵培養基中，發酵培養14～18小時后，開始補加甲醇進行誘導表達，同時向發酵培養基中加入丙酮酸鈉，其中丙酮酸鈉的加入量為0.01～10g/L。2.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述的丙酮酸鈉的加入量為0.1g/L～1g/L。3.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述的畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，保藏編號為CGMCC No.5021。4.根據權利要求1或2所述的發酵工藝，其特征在于，所述的丙酮酸鈉的加入方式為流...

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜爾鳳，黃建民，高力虎，趙健烽，陶海，馮麗萍，周愛梅，季樂，
申請(專利權)人：江蘇江山聚源生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32