本發明專利技術公開了一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的重組載體及方法，重組載體由骨架載體和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表達框構成，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框位于載體啟動子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之間由2A序列連接。本發明專利技術的重組載體，同時表達多個基因，表達的蛋白可以高效自剪切為F2和F1，進而形成F1?F2同源三聚體。本發明專利技術方法可以高效制備得到純化的F蛋白，得到的純化F蛋白可以作為抗原使用，可以誘導高水平的抗體免疫反應。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術和生物醫藥領域，具體涉及一種表達RSV F蛋白重組載體及F蛋白制備方法。
技術介紹
人呼吸道合胞病毒（RSV）是副粘病毒科、肺炎病毒亞科、肺病毒屬的病原性病毒。RSV的基因組是編碼11個蛋白的負鏈RNA分子。RNA基因組與病毒N蛋白緊密關聯形成包裹在病毒包膜內的核衣殼。根據G糖蛋白的抗原性的不同，已有A和B兩個亞型。RSV主要感染鼻腔以及肺部大、小氣道的上皮細胞，也可能感染肺泡巨噬細胞和肺部其他類型的細胞。機體在對抗RSV感染中起主要作用的是細胞免疫，其中細胞毒性T淋巴細胞（CTL）是清除受病毒感染細胞的關鍵因素。CD4+T細胞和CD8+T細胞在清除上、下呼吸道內的病毒過程中均能發揮有效的作用。在RSV外膜具有G、F、SH等跨膜糖蛋白，共同參與病毒外膜與宿主細胞膜的融合以及細胞培養過程中合胞體的形成，其中G、F為兩個重要的膜蛋白成分。G蛋白不僅與病毒和細胞的黏附有關，而且RSV病毒的A、B兩亞型的主要差異也存在于G蛋白中，并且G蛋白在亞型間及亞型內變異極大，是RSV逃逸機體免疫攻擊的重要手段。F蛋白與病毒進入細胞并形成特征性的合胞體有關，還具有促使RSV在感染細胞間傳播及溶血的作用。F和G蛋白是激發機體產生保護性抗體最主要的病毒抗原。但G蛋白具有較高的亞型特異性及變異性，故不宜制成疫苗，與之相比F蛋白的抗原性比較穩定，較少變異，并且F蛋白是誘導機體產生免疫保護的主要蛋白，它誘導產生的抗體能保護機體免受RSV A、B兩亞型病毒的侵襲，而G蛋白抗體僅對同亞型病毒提供保護，所以F蛋白更有研究價值。雖然已研制過多種形式的RSV疫苗，如福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、亞單位疫苗和減毒疫苗、冷適應株疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗等，但至今尚無可用于預防RSV感染的疫苗問世。同時，由于FI-RSV失敗的陰影及RSV疫苗研制中面臨的動物模型局限、免疫接種人群免疫系統發育不成熟、母傳抗體干擾和存在兩種不同抗原亞型等諸多復雜問題，使學術界及產業界一度等對成功研制出有效的RSV疫苗產生了懷疑和悲觀情緒。不過，隨著阿斯利康醫學免疫公司和美國生物制藥Novavx公司疫苗候選物的研發，特別是Novavx公司的F蛋白納米粒子基因工程呼吸道合胞病毒疫苗已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床實驗，證明肌肉注射該疫苗的耐受性良好，具有較好的免疫原性，因此研究F蛋白基因工程疫苗具有廣闊的前景。RSV F蛋白由mRNA翻譯為約574個左右氨基酸的蛋白，稱為F0。F0的翻譯后加工包括通過內質網中的信號肽酶移除N端信號肽。轉運高爾基體內的細胞蛋白酶（特別是弗林蛋白酶（furin））還在兩個位置（約109/110和約136/137）切割F0。該切割導致短干擾序列移除并產生兩種仍彼此相關的亞基，稱為F1（約50kDa，C端約為殘基137-574）和F2（約20kDa，N端，約為殘基1-109）。F1在N端含疏水性融合肽以及2個兩性七肽重復區(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜結構域。3個F1-F2異源二聚體在病毒粒子中組裝為F1-F2同源三聚體。由于RSV F蛋白加工、構造和重折疊的復雜性，比較難以獲得純化的、均質的免疫原性制備物。RSV F0 在形成具有免疫原性的抗原物之前需要弗林蛋白酶的酶切，在昆蟲細胞表達系統中弗林蛋白酶表達量不足或者活性不高，導致F0不能完全被切割為F2和F1，影響F1-F2同源三聚體的形成，嚴重限制了F蛋白的表達效率。此外，F蛋白的純化也是極為重要的，現有技術缺乏高效的F蛋白純化方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種高效表達RSV F蛋白的重組載體及方法，該表達載體表達的F蛋白在不需要弗林蛋白酶存在的情況下高效剪切為F2和F1。本專利技術所采取的技術方案是：一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體，由骨架載體和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表達框構成，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框位于載體啟動子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之間由2A序列連接；2A序列為編碼含D-X-E-X-N-P-G-P氨基酸序列的核酸序列。優選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體中，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框的序列根據宿主細胞的偏好性進行密碼子優化。優選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的宿主細胞為Spodoptera frugiperda草地夜蛾細胞Sf9。優選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的骨架載體選自pFastBacTM-1和pFastBacTM-dual。優選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的F1蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。優選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的F2蛋白基因序列如SEQ ID NO：2所示。優選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的2A序列如SEQ ID NO：3所示。一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，包括如下步驟：1)使用上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體轉化大腸桿菌DH10 multiBac感受態細胞，培養后提取重組大腸桿菌DH10 multiBac的質粒，獲得重組桿狀病毒載體；2)使用重組桿狀病毒載體轉染Sf9細胞，培養后得到包含編碼F蛋白基因的重組桿狀病毒；3)使用包含編碼F蛋白基因的重組桿狀病毒感染宿主細胞，培養至產生足夠的F蛋白；4)收集宿主細胞并使用裂解液裂解細胞，裂解液的組成為25 mM Tris-Cl (pH 8.0)、50 mM NaCl, 0.1 % NP9；5)去除細胞碎片，得到的清液分別經過強陰離子柱EMD TMAE、外源凝集素親和介質GST-Sepharose 4B和強陽離子EMD SO3純化，得到純化的呼吸道合胞病毒F蛋白。本專利技術的有益效果是：本專利技術的重組載體，同時表達多個基因，表達的蛋白可以高效自剪切為F2和F1，進而形成F1-F2同源三聚體。本專利技術方法可以高效制備得到純化的F蛋白，得到的純化F蛋白可以作為抗原使用，可以誘導高水平的抗體免疫反應。附圖說明圖1是Bac- F2-2A-F1免疫熒光和Western blot分析圖；圖2是Bac- F2-2A-F1 F蛋白SDS-PAGE和Western blot分析圖；圖3是F蛋白免疫小鼠血清中和RSV A2中和抗體分析；圖4是不同優化序列的蛋白表達情況；圖5是不同培養基對蛋白表達情況的影響。具體實施方式下面結合具體實驗，進一步說明本專利技術的技術方案。1主要材料病毒：RSV long RSV A2；細胞：昆蟲細胞Sf9。1.2 主要試劑PremerStar DNA聚合酶（大連寶生物）；Bac重組桿狀質粒提取試劑盒（Omiga生物）；卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal、IPTG（北京鼎國）；LB培養基（Sigma）；Grace's培養基、FBS（Gibco)；Cellfectinll脂質體（Sigma）；Palivizumab單抗；HRP羊抗人二抗（Invitrogen）；Donkey Anti-human Alexa Fluor 488(Invitrogen)。表達呼吸道合胞病毒F蛋白載體的構建根據宿主細胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）細胞系的偏愛性進行密碼子蟲源優化，得到優化后的RSV F1蛋白和F2蛋白的基因序列，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體，由骨架載體和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表達框構成，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框位于載體啟動子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之間由2A序列連接；2A序列為編碼含D?X?E?X?N?P?G?P氨基酸序列的核酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體，由骨架載體和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表達框構成，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框位于載體啟動子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之間由2A序列連接；2A序列為編碼含D-X-E-X-N-P-G-P氨基酸序列的核酸序列。2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于：呼吸道合胞病毒F蛋白表達框的序列根據宿主細胞的偏好性進行密碼子優化。3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于：宿主細胞為Spodoptera frugiperda草地夜蛾細胞Sf9。4.根據權利要求1所述的載體，其特征在于：骨架載體選自pFastBacTM-1和pFastBacTM-dual。5.根據權利要求3所述的載體，其特征在于：F1蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。6.根據權利要求3所述的載體，其特征在于：F2蛋白基因序列如SEQ ID NO：2所示。7.根據權利要求3所述的載體，其特征在于：2A序列如SEQ ID NO：3所示。8.一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：彭濤，許煜華，盧全占，馬書智，王弋，尹海濱，安鴻，
申請(專利權)人：廣東華南聯合疫苗開發院有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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