本發明專利技術公開了鹽芥耐低磷基因ThPHT1?4及重組載體及應用，鹽芥耐低磷基因ThPHT1?4是序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。該基因在提高植物耐低磷性能的應用。采用該基因轉染的擬南芥表現出對低磷脅迫的耐受力，說明本發明專利技術提供的耐低磷基因ThPHT1?4在改良作物耐低磷的能力方面，起著重要的作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學和生物
，更加具體地說，涉及一種鹽芥耐低磷基因及應用。
技術介紹
磷是生物生長發育的重要營養元素之一，是蛋白質、核酸、脂類以及各種重要的小分子的重要組成成分，在植物新陳代謝過程中扮演著十分重要的角色。然而，磷是一種不可再生的資源，大部分土壤有效磷含量較低，難以滿足植物生長的正常需求。據報道，世界上至少有30％～40％的作物產量受到低磷脅迫的嚴重抑制(Runge-Metzger A.)。農業生產上，主要通過施用磷肥來解決土壤磷缺乏問題，但是使用的磷肥很容易被土壤固定為作物不易吸收的難溶性磷，難以完全滿足作物對磷的需求。因此，提高植物對磷的吸收和利用率，創制耐低磷作物品種，對于減少農業磷的施用量，維護生態安全，提高作物的產量等方面具有重要意義。隨著對植物低磷脅迫應答的分子機理研究不斷深入，特別是以擬南芥為研究對象，植物在低磷脅迫條件下的研究取得了突破性的進展。目前，對具有耐低磷性能的基因的分離是當前利用基因工程方法進行耐低磷作物培育的首要任務。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種鹽芥耐低磷基因。本專利技術的第二個目的是提供一種含鹽芥耐低磷基因的重組載體。本專利技術的第三個目的是提供一種含上述重組載體的宿主細胞。本專利技術的第四個目的是提供一種鹽芥耐低磷基因在提高植物耐低磷的應用。本專利技術的技術方案概述如下：一種鹽芥耐低磷基因ThPHT1-4，所述基因是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。含一種鹽芥耐低磷基因ThPHT1-4的重組載體。含上述重組載體的宿主細胞。一種鹽芥耐低磷基因ThPHT1-4在提高植物耐低磷性能的應用。本專利技術的鹽芥耐低磷基因ThPHT1-4，從鹽芥中獲取并具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，采用該基因轉染的擬南芥表現出對低磷脅迫的耐受力，說明本專利技術提供的耐低磷基因ThPHT1-4在改良作物耐低磷的能力方面，起著重要的作用。附圖說明圖1是本專利技術的鹽芥耐低磷ThPHT1-4基因克隆電泳示意圖。圖2是包含本專利技術的鹽芥耐低磷的基因ThPHT1-4的表達載體示意圖。圖3是pCAMBIA3301_ThPHT1-4轉化農桿菌C58PCR篩選結果。圖4是ThPHT1-4轉基因擬南芥T3純合體半定量PCR結果。圖5是ThPHT1-4轉基因擬南芥T3純合體耐低磷根系實驗效果。具體實施方式本專利技術中涉及到的實驗材料、所用試劑來源如下：鹽芥：由中國科學院植物所李銀心教授帶領，采自北京大興區鹽漬化的農田邊。pJET1.2：購自賽默飛公司http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.htmlpDONR201:購自賽默飛公司http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.htmlpCAMBIA3301:購自賽默飛公司http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.htmlDH5α感受態細胞，反轉錄試劑盒：購自北京北京全式金生物技術有限公司，http://www.transgen.com.cn/shop.html。膠回收試劑盒：購自寶生物工程公司，http://www.takara.com.cn/。農桿菌菌株C58：購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com。本專利技術中涉及到的反應體系：BP反應：attB-PCR 1ulPDonr 201 0.5ul1×TE Buffer(PH8.0)to 4ulLR反應：Entry clone(100ng/ul) 1ulDestination vector(150ng/ul) 0.5ul1×TE Buffer(PH8.0) 2.5ul實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下面結合具體實施例進一步說明本專利技術的技術方案。實施例1一種鹽芥耐低磷基因的獲得首先，以采自農田邊的鹽芥為原料，利用基因克隆技術，獲取本專利技術的鹽芥耐低磷ThPHT1-4基因。取生長了五周的新鮮鹽芥植株，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Trans gene Code#EP101-0150rxns)提取total RNA，并且利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Trans gene Code#AE301-03 100rxns)去除基因組DNA干擾，反轉錄出cDNA。在Phytozome和TAIR數據庫中，找出擬南芥全部PHT1基因(9個)，然后將這些AtPHTs放入phytozome的鹽芥數據庫中進行檢索。再利用獲得的鹽芥PHT1基因，在phytozome再次檢索，共找到14個鹽芥PHT1基因。對ThPHT1s基因進行了蛋白全序列對比，繪制了鹽芥與擬南芥PHT1家族基因和系統發生樹，將與AtPHT1-4親緣關系最近的鹽芥Thhalv10006497m命名為ThPHT1-4，并進行基因克隆。本實驗根據鹽芥ThPHT1-4基因序列設計上游引物：PHT-F(SEQ ID NO.2所示，5'-CTCATTCCACTTCCTTTCTCTCTC-3')和下游引物：PHT-R(SEQ ID NO.3所示,5'-AAAAGGCGTATTGTCACCTAAACTA-3')，以鹽芥葉片cDNA為模板，進行基因克隆，得到完整ThPHT1-4基因全長為1791bp(SEQ ID NO.1所示)為本專利技術中所述鹽芥耐低磷基因，見圖1。實施例2含鹽芥耐低磷基因的重組載體pCAMBIA3301_ThPHT1-4的構建構建含有本專利技術的鹽芥耐低磷基因的中間載體pJET1.2_ThPHT1-4、pDONR201_ThPHT1-4和植物表達載體pCAMBIA3301_ThPHT1-4，見圖2。將膠回收純化后的目的片段，純化后的鹽芥耐低磷基因(ThPHT1-4基因)，利用CloneJETPCR Cloning Kit(Clone JET PCR Cloning Kit#K1231 20rxns，Thermo)進行pJET1.2_ThPHT1-4克隆載體的構建，并轉化DH5α感受態細胞。利用目的片段的上下游引物PHT-F(SEQ ID NO.2)和PHT-R(SEQ ID NO.3)對菌落進行PCR篩選，陽性菌送測序。提取測序正確菌液的質粒進行BP反應，BP反應中所需的載體為pDONR201，篩選出陽性克隆(pDONR201_ThPHT1-4)，進行測序。同時，提取測序正確的BP菌質粒進行LR反應，LR反應中所需載體為pCAMBIA3301表達載體，反應后篩選陽性克隆，將篩選出的陽性克隆擴大培養，提取質粒，轉化C58感受態細胞。即鹽芥耐低磷基因的植物表達載體pCAMBIA3301_ThPHT1-4的構建。實施例3鹽芥耐低磷基因ThPHT1-4在提高植物耐低磷性能方面的應用利用實施例2篩選的pCAMBIA3301_T本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鹽芥耐低磷基因ThPHT1?4，其特征是所述基因是序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種鹽芥耐低磷基因ThPHT1-4，其特征是所述基因是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.含權利要求1一種鹽芥耐低磷基因T...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊少輝，寇瑩瑩，王潔華，宋英今，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：天津;12
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