檢測FII基因3’UTR序列的引物和方法技術

本發明專利技術公開了檢測FII基因3’UTR突變位點的引物和方法，所述引物包括擴增覆蓋FII基因3’UTR端序列的正、反向引物和測序引物。基于采用Sanger測序法，利用所述測序引物可用于快速檢測靜脈血栓患者的FII基因3’UTR序列的突變情況，其中包含了位于3’UTR的主要突變位點G20210A。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生命科學和生物
，特別涉及檢測FII基因3’UTR序列的引物和方法。
技術介紹
易栓癥是由于抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等遺傳性或獲得性缺陷或存在獲得性危險因素而容易發生血栓栓塞的狀態，主要臨床表現類型為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)。易栓癥可分為遺傳性易栓癥與獲得性易栓癥，遺傳性危險因素目前主要有：凝血因子V(factor V，FV)Leiden變異、蛋白C(PC)缺乏、蛋白S(PS)缺乏，凝血酶原G20210A(FIIG20210A)基因變異、抗凝血酶(AT)缺乏，高同型半胱氨酸血癥等。凝血酶原(prothrombin，PT)即凝血因子II(FII)是最早被提純和測定氨基酸順序的凝血因子。凝血酶原基因位于第11號染色體，基因長21kb，有14個外顯子和13個內含子編碼，其mRNA為2kb，合成622個氨基酸的肽鏈，其中前導肽43個氨基酸，在分泌過程中裂解。1996年，Poort等報道PT基因3’端未轉錄區20210位核苷酸G→A的變異在首次血栓患者中的發生率為6.2％，健康人群中的發生率為2.3％，PT基因G20210A變異的雜合體靜脈血栓形成的危險較正常人增加2.8倍。研究表明，凝血酶原基因(FII)3’端非翻譯區第20210位核苷酸G→A的突變與血漿凝血酶原水平的增高有關，凝血酶原水平增高可使活化蛋白C(APC)的抗凝作用減弱，抑制APC滅活FVa的速度，產生活化蛋白C抵抗(APCR)，使血栓形成的風險加大。蛋白截斷試驗(PTT)、單鏈構象多態性(SSCP)、異源雙鏈分析(HA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)等均被應用于FII基因突變的檢測,但所有這些方法均有一定的局限性,從而限制了基因突變的檢出率。由于FII基因容量大、突變類型多、突變率高、突變位點散在分布,故而阻止了對FII基因突變的深入研究，熒光定量PCR法并不適用。
技術實現思路
本專利技術提供檢測FII基因3’UTR序列的引物，采用Sanger測序法，可用于快速檢測靜脈血栓患者體內FII基因3’UTR序列突變的情況。擴增覆蓋檢測FII基因3’UTR序列突變的正向引物(20210-F)和反向引物(20210-R)的堿基序列為：20210-F：5'-GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3'20210-R：5'-ATAGCACTGGGAGCATTGACGC-3'。進一步地，所述引物還包括正向測序引物(20210-F)和反向測序引物(20210-R)，其堿基序列為：20210-F：5'-GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3'20210-R：5'-ATAGCACTGGGAGCATTGACGC-3'。進一步地，所述擴增的正、反向引物的使用濃度比為：20210-F：20210-R＝1:1。進一步地，所述測序的正反向引物的使用濃度比為：20210-F：20210-R＝1:1。本專利技術的目的還在于提供一種檢測FII基因3’UTR序列的方法，其包括如下步驟：(1)提取樣品DNA；(2)利用擴增引物20210-F與20210-R對(1)中的DNA分別進行擴增，獲得覆蓋檢測FII基因3’UTR序列突變的擴增產物；(3)利用測序引物20210-F與20210-R對(2)中的擴增產物分別進行正向和反向測序，獲得所述擴增產物的基因序列；(4)將(3)中的基因序列與野生型FII基因序列進行比較，確定突變位點是否存在；其中所述引物序列為：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。本專利技術的目的還在于提供一種檢測FII基因3’UTR序列的試劑盒，包括樣品DNA抽提試劑、無水乙醇、檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應液包括擴增引物20210-F與20210-R，測序體系包括測序引物20210-F與20210-R，引物序列為：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。進一步地，所述檢測體系PCR反應液還包括2×PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNA Polymerase。進一步地，所述測序體系還包括測序純化液、EDTA、無水乙醇、75％乙醇、和HIDI。進一步地，所述測序純化液包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。本專利技術設計了擴增覆蓋檢測FII基因3’UTR序列的正、反向引物，以及對所獲得的擴增產物進行正反向測序的測序引物。對送檢樣本進行PCR擴增，采用Sanger測序法，對PCR產物進行正反向測序反應擴增、純化后變性、直接測序可以全面地檢測FII基因3’UTR序列的突變情況。通過調整正反向引物的濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。有益效果：利用本專利技術所述擴展引物和測序引物，可以擴展整個3’UTR序列，通過測序結果的分析，可以很直觀地了解FII基因3’UTR序列的基因突變情況，并不受FII基因突變多樣化以及沒有突變熱點的影響，可覆蓋待檢測的所有突變位點；具有很高的特異性及準確性；采用PCR方法擴增目的基因并測序檢測其基因多態性，具有靈敏度高，操作簡單、成本低等優點。FII突變情況的檢測對靜脈血栓栓塞癥有重要意義。附圖說明圖1為FII基因在染色體上定位圖圖2為20210-F/R的電泳圖，M為Marker DL 2000，1-24為送檢的患者血液樣本1-24號，如圖2所示，引物20210-F/R擴增有效，且條帶單一。圖3、4、5、6、7、8分別為樣本3、5、6FII基因3’UTR的正、反向的測序截圖。其中方框內為FII基因3’UTR G20210A的位置，圖中測序結果顯示這些樣品均未發生突變。圖9為樣品3的整個3’UTR序列測序圖。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本專利技術。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例1檢測FII基因3’UTR序列的引物，包括：擴增覆蓋檢測FII基因3’UTR序列的正、反向引物；所述擴增引物的堿基序列為：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。在檢測中，先利用上述正、反向引物對FII基因3’UTR序列的DNA片段進行擴增，獲得擴增產物，然后利用上述測序引物對擴增產物進行測序，獲得擴增產物的基因序列。在引物設計上，所設計的每對引物都位于所要擴增的序列兩側，即擴增區域包括了該序列的全部序列。雖然FII基因在靜脈血栓患者中有較為主要的突變位點G20210A(在3’UTR序列上)，但不明確的突變位點也很多，突變類型不定。因此本專利技術所述引物既能將所述全部外顯子序列都擴增出來，也保證無論3’UTR序列的何處位置發生突變，都不會出現漏檢的情況。檢測FII基因3’UTR序列的試劑盒，包括：組織DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應液本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測FII基因3’UTR序列的引物，其特征在于，包括：擴增覆蓋FII基因3’UTR序列的正向引物和反向引物，其堿基序列為：20210?F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT?3'20210?R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC?3'。

【技術特征摘要】
1.檢測FII基因3’UTR序列的引物，其特征在于，包括：擴增覆蓋FII基因3’UTR序列的正向引物和反向引物，其堿基序列為：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括正向測序引物和反向測序引物，其堿基序列為：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。3.如權利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向引物和反向引物的使用濃度比為：20210-F：20210-R＝1：1。4.如權利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向測序引物和反向測序引物的使用濃度比為：20210-F：2021...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉趙玲，單戰，王淑一，
申請(專利權)人：南京艾迪康醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32