一株高效降解嘔吐毒素的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp． D II?9制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一株高效降解嘔吐毒素（DON）的伊格爾茲氏菌Eggerthella?sp.?D?II?9。該菌株已于2016年6月23日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為GDMCC?NO：60049。該菌株可高效地將DON完全降解成其弱毒產(chǎn)物——脫環(huán)氧嘔吐毒素（DOM?1）。該菌株具有DON降解活性pH值范圍廣（5～10）和溫度范圍廣（30～45℃）的特點(diǎn)，且其活性的維持不依賴于培養(yǎng)體系中DON的持續(xù)存在。該菌株可應(yīng)用于DON脫環(huán)氧酶及DON脫毒制劑的制備，在DON的脫毒方面具有良好的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于微生物篩選及霉菌毒素降解
更具體地，涉及一株高效降解嘔吐毒素的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9。
技術(shù)介紹
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），因能引起豬、狗、貓等動(dòng)物嘔吐反應(yīng)，故又稱為嘔吐毒素（vomitoxin）。DON污染糧谷的情況非常普遍，許多糧谷類都受到嚴(yán)重污染，如小麥、燕麥、大豆和黑麥等。中國(guó)、巴西、美國(guó)、阿根廷和南非等世界各地均有DON污染糧食的報(bào)導(dǎo)。2016年在中國(guó)山東調(diào)查了359份面粉樣品的霉菌毒素污染狀況，發(fā)現(xiàn)DON的檢出率最高，達(dá)到97.2%，平均污染濃度為86.7 μg/kg（Li et al., 2016）。不僅在糧谷作物中DON的污染嚴(yán)重，在飼料原料及全價(jià)配合飼料中的污染也很普遍。2012~2014年，隨機(jī)收集的我國(guó)中部地區(qū)飼料及配合飼料190份，DON的陽(yáng)性率為77.4%（Liu et al., 2016）。DON是一種毒性很強(qiáng)的霉菌毒素，可使人和動(dòng)物體重減輕，腹瀉，擾亂腸道系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)、并影響內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等（Tang et al., 2015），并能通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)血腦屏障，從而造成潛在的神經(jīng)毒性（Behrens et al., 2015）。DON抑制蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的增殖，從而可能導(dǎo)致基因毒性、細(xì)胞毒性等（Lautert et al., 2014）。豬是對(duì)DON最敏感的動(dòng)物，當(dāng)飼料中DON濃度達(dá)到1~2 ppm就會(huì)使采食量降低（Prelusky et al., 1994）。DON是單端孢霉烯族化合物B類，其化學(xué)名為12，13-環(huán)氧-3α，7α，15-三羥基單端孢霉-9-烯-8酮，分子式為C15H20O6。DON具熱穩(wěn)定性，能耐170～350℃的高溫，并耐酸堿。目前，DON的脫毒方法主要包括物理、化學(xué)、生物方法三類。物理脫毒法主要有活性碳及蒙脫石吸附（Abdel-Wahhab et al., 2015）、漂洗研磨、高溫處理等；化學(xué)脫毒方法包括酸、堿、氧化劑等的處理。但是，不管是物理的還是化學(xué)的方法，都有可能帶來(lái)二次污染、影響口感、降低糧食的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。相對(duì)傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法，生物方法越來(lái)越受到研究者的重視。生物脫毒即生物降解是通過(guò)微生物或者酶將有毒的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒甚至無(wú)毒的代謝產(chǎn)物（Awad et al., 2010）。DON的主要毒性基團(tuán)是C12、13的環(huán)氧基團(tuán)，研究表明其脫環(huán)氧產(chǎn)物DOM-1的毒性只相當(dāng)于DON原藥的1/55（Sundstol et al., 2004），是公認(rèn)的一種解毒途徑。國(guó)外雖有具DON脫環(huán)氧代謝能力的微生物報(bào)道，但和本專利技術(shù)所述的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9屬于不同科，有很大的區(qū)別，且均被注冊(cè)專利。國(guó)內(nèi)尚無(wú)DON脫環(huán)氧代謝微生物的報(bào)道。因此，分離具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的 DON脫環(huán)氧代謝微生物對(duì)于我國(guó)研究開(kāi)發(fā)DON的生物脫毒劑及其在飼料生產(chǎn)和食品加工上的應(yīng)用具有十分重要的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一株具備高效嘔吐毒素（Dexoynivaneol, DON）脫環(huán)氧代謝能力的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9。本專利技術(shù)的另一目的是提供一種高效降解嘔吐毒素的微生物制劑。本專利技術(shù)上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一株高效降解嘔吐毒素的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，大小為0.2～0.3μm×0.7～1.0μm，呈細(xì)桿狀，無(wú)鞭毛。該菌株已于2016年6月23日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為GDMCC NO：60049。該菌株是從雞腸道微生物中分離篩選得到的，具體的分離篩選方法包括抗生素篩選、梯度稀釋篩選、96孔板篩選、比較宏基因組學(xué)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、電鏡觀察和16S rDNA鑒定等。該菌株能夠高效地將DON完全降解成脫環(huán)氧嘔吐毒素（Deepoxideoxinivalenol, DOM-1）。 該菌株在體外最適培養(yǎng)條件下，100～1000 CFU接種到200μl 體系，24～48 h內(nèi)可以將DON完全轉(zhuǎn)化為DOM-1。而且，該菌株對(duì)DON降解活性的維持不依賴于DON的持續(xù)存在，在不含DON的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)多代不會(huì)導(dǎo)致活性降低或丟失。優(yōu)選地，該菌株在改良營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述改良營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 培養(yǎng)基的配方為：營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 15～20g/L、L-Arg 0.5～1.5g/L。具體優(yōu)選地，所述改良營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 培養(yǎng)基的配制方法為：首先稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 15～20g/L、L-Arg 0.5～1.5g/L溶于蒸餾水中，滅菌。更優(yōu)選地，所述改良營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 培養(yǎng)基的配制方法為：首先稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 18g/L、L-Arg 1g/L溶于蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。另外，優(yōu)選地，該菌株的培養(yǎng)條件為：在含80% N2、10% H2和10% CO2的混合氣體環(huán)境中，pH為5～10，溫度為30～45℃。更優(yōu)選地，所述pH最佳為6.5～10。另外，包含上述伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9的DON脫毒制劑，以及以上述伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9為基礎(chǔ)構(gòu)建得到的DON脫毒工程菌，也在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍之內(nèi)。由述伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9中提取得到DON脫環(huán)氧代謝酶也應(yīng)在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍之內(nèi)。本專利技術(shù)具有以下有益效果：本專利技術(shù)提供了一株具備高效嘔吐毒素脫環(huán)氧代謝能力的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9，該菌株是從雞腸道微生物中分離篩選得到的，能將嘔DON高效降解成DOM-1，該菌株在體外最適培養(yǎng)條件下，100～1000 CFU接種到200 μl 體系，24～48 h內(nèi)可以將DON完全轉(zhuǎn)化為DOM-1。而且，該菌株對(duì)DON降解活性的維持不依賴于DON，在不含DON的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)多代不會(huì)導(dǎo)致活性降低或丟失。該菌株活性穩(wěn)定、代謝能力強(qiáng)、代謝溫度和pH值范圍廣，可用于飼料加工和食品加工領(lǐng)域DON的脫毒、飼料加工和食品加工領(lǐng)域DON脫毒制劑的制備，以及DON脫環(huán)氧代謝相關(guān)酶的分離、DON脫環(huán)氧代謝工程菌的制備、DON脫環(huán)氧代謝酶制劑的制備和DON耐受轉(zhuǎn)基因植物的培育等方面。附圖說(shuō)明圖1為雞腸道微生物DON脫環(huán)氧代謝能力的HPLC檢測(cè)結(jié)果；A為DON，DOM-1標(biāo)品的HPLC檢測(cè)結(jié)果，B為雞腸道微生物代謝DON情況。圖2為伊格爾茲氏菌的革蘭氏鑒定。圖3為伊格爾茲氏菌的電鏡觀察圖片。圖4為伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖5為不同溫度條件下伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9代謝DON的結(jié)果（1：100接種）。圖6為不同pH條件下伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9代謝DON的結(jié)果（1：100接種）。圖7為最適條件下Eggerthella sp. D II-9代謝DON的HPLC檢測(cè)結(jié)果；A為DON，DOM-1標(biāo)品的HPLC檢測(cè)結(jié)果，B為該菌株最適條件下代謝DON情況。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本專利技術(shù)，但實(shí)施例并不對(duì)本專利技術(shù)做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本專利技術(shù)采用本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株高效降解嘔吐毒素的伊格爾茲氏菌Eggerthella?sp.?D?II?9，其特征在于，該菌株已于2016年6月23日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為GDMCC?NO：60049。

【技術(shù)特征摘要】
1.一株高效降解嘔吐毒素的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9，其特征在于，該菌株已于2016年6月23日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為GDMCC NO：60049。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9，其特征在于，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，該菌株大小為0.2～0.3μm×0.7～1.0μm，呈細(xì)桿狀，無(wú)鞭毛。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊格爾茲氏菌Eggerthella sp. D II-9，其特征在于，培養(yǎng)該菌株的培養(yǎng)基為：改良營(yíng)養(yǎng)肉湯NB 培養(yǎng)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄧詣群，高小娟，母培強(qiáng)，陳慶梅，文繼開(kāi)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44