胞外核酸的固定和分離制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供采用聚氧乙烯聚合物或乙二醇作為固定劑固定含細(xì)胞生物樣本中的胞外核酸群的方法、組合物和裝置。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本技術(shù)涉及用于固定(stablize)含細(xì)胞樣本，尤其是血液樣本中胞外核酸群的方法和組合物，并涉及用于從相應(yīng)固定的生物樣本中分離胞外核酸的方法。
技術(shù)介紹
已經(jīng)于血液，血漿，血清和其它體液內(nèi)鑒定出胞外核酸。由于它們免受核酸酶破壞的事實(shí)(例如，由于它們以蛋白脂質(zhì)復(fù)合物的形式被分泌，與蛋白質(zhì)結(jié)合或包含在囊泡內(nèi))，各樣本中發(fā)現(xiàn)的胞外核酸在一定程度上難降解。在許多醫(yī)療條件、惡性腫瘤和感染過程中水平升高的胞外核酸如DNA和/或RNA的存在受到特別關(guān)注，用于篩選，診斷，預(yù)后，監(jiān)測疾病進(jìn)展，用于識別潛在的治療目標(biāo)，并用于監(jiān)測治療反應(yīng)。另外，母體血液中升高的胎兒DNA/RNA用于，例如性別鑒定、評估染色體異常和監(jiān)控妊娠相關(guān)的并發(fā)癥。因此，胞外核酸在非侵入性診斷和預(yù)后中是特別有用的，并可以在許多應(yīng)用領(lǐng)域，如非侵入產(chǎn)前遺傳檢測、腫瘤、移植醫(yī)學(xué)或許多其他疾病中用作，例如診斷標(biāo)志物，并因此是診斷相關(guān)的(例如來自胎兒或腫瘤的核酸)。但是，在健康人類中也發(fā)現(xiàn)了胞外核酸。胞外核酸的常規(guī)應(yīng)用和分析方法描述于，例如WO97/035589；WO97/34015；Swarup等,FEBS Letters 581(2007)795-799；Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)；Fleischhacker和Schmidt,生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(Biochmica et Biophysica Acta),1775,(2007),191-232；Hromadnikova等(2006)DNA和細(xì)胞生物學(xué)(DNA and Cell biology),25卷,11期,635-640頁；Fan等(2010),臨床化學(xué)(Clinical Chemistry),56:8中。胞外核酸通常僅以低濃度包含在樣本中。例如，游離循環(huán)的核酸以1-100ng/ml血漿的濃度存在于血漿中。此外，胞外核酸經(jīng)常以500nt、300nt(當(dāng)表示大小和由此的鏈長時，術(shù)語“nt”也還包括“bp”，在DNA情況下)或甚至更小(循環(huán)核小體)的片段循環(huán)。對于血漿中的ccfDNA，平均長度通常僅為約140-170bp。另外，假設(shè)被識別用于診斷目的的實(shí)際目標(biāo)胞外核酸通常也僅代表一小部分總胞外核酸。對于ccfDNA，通常只有幾千份可擴(kuò)增拷貝存在于每毫升血液中，取決于例如懷孕狀態(tài)或腫瘤分級。特別地，腫瘤特異性DNA片段是非常罕見的，所含濃度經(jīng)常比“正常”胞外核酸背景少1000倍。這種低濃度給樣本的固定和隨后從固定樣本分離胞外核酸帶來了挑戰(zhàn)。除了在血清，也可能在血漿中發(fā)生的降解外，分析來自例如腫瘤或有關(guān)胎兒起源的循環(huán)、無細(xì)胞核酸(cfNA)的主要問題是樣本采集后來自受損或破壞的細(xì)胞的遺傳物質(zhì)可能稀釋胞外DNA(和RNA)。收集樣本后，由于離體孵育期間，特別是樣本收集后相對較短的時間內(nèi)細(xì)胞破碎，細(xì)胞核酸從樣本中含有的細(xì)胞釋放。一旦細(xì)胞裂解開始，裂解的細(xì)胞釋放大量其他的核酸，它們與胞外核酸混合，且變得越來越難以回收胞外核酸用于檢測。對于血液樣本，特別是白血細(xì)胞的裂解是問題，因?yàn)樗鼈冡尫糯罅炕蚪MDNA和RNA。紅血細(xì)胞不含有基因組DNA。因此，固定全血中循環(huán)的核酸必須包括固定血細(xì)胞的機(jī)制，以便防止固定期間胞外核酸群被細(xì)胞基因組DNA和RNA污染。尤其是胞外核酸，特別是罕見目標(biāo)的胞外核酸的稀釋是問題，必須被阻止。這些問題在現(xiàn)有技術(shù)中討論(參見例如Chiu等(2001),臨床化學(xué)(Clinical Chemistry)47:9 1607-1613；Fan等(2010)和US2010/0184069)。此外，由于降解，可用胞外核酸的量和可回收利用性可在一段時間實(shí)質(zhì)上減少。除了來自如腫瘤細(xì)胞或胎兒的哺乳動物胞外核酸，含細(xì)胞樣本也可能包括其他受關(guān)注的核酸，它們沒包含在細(xì)胞內(nèi)。重要的、非限制的實(shí)例是病原體核酸，如病毒核酸。在運(yùn)輸和處理過程中含細(xì)胞樣本如特別是血液標(biāo)本中病毒核酸完整性的保護(hù)，對于隨后的分析和病毒載量監(jiān)測也是至關(guān)重要的。樣本收集后，胞內(nèi)核酸的釋放尤其是問題，如果樣本包含大量細(xì)胞，例如與全血樣本情況一樣。因此，為了避免分別減少上述問題，通常的做法是獲得樣本之后基本上立即從包含在樣本中的細(xì)胞分離樣本的基本無細(xì)胞部分。例如，建議抽血后基本上立即從全血獲得血漿和/或冷卻該全血和/或所獲得的血漿或血清，以維持胞外核酸的完整性，并避免胞外核酸群被從包含細(xì)胞釋放的胞內(nèi)核酸污染。但是，獲得樣本的基本無細(xì)胞部分是有問題的，分離經(jīng)常是冗長耗時的多步驟的過程，因?yàn)椴捎米屑?xì)控制的條件防止離心期間細(xì)胞破碎(破碎過程中釋放的細(xì)胞核酸能夠污染胞外核酸)是重要的。至于樣本處理，需要從血液直接分離如血漿也是主要缺陷，因?yàn)楹线m的設(shè)備在收集樣本的部位不一定可用。此外，經(jīng)常難以除去所有的細(xì)胞。因此，通常和一般歸為“無細(xì)胞”的許多處理的樣本，如血漿或血清實(shí)際仍含有在分離過程中沒有去除的殘余量細(xì)胞。在樣本處理過程中這些細(xì)胞也可能被破壞或可能死亡，從而釋放胞內(nèi)核酸，特別是基因組DNA，如上所述。這些殘留細(xì)胞也帶來風(fēng)險，在處理期間它們被破壞，使它們的核酸成分，特別是基因組(核)DNA和細(xì)胞質(zhì)RNA，將與胞外循環(huán)核酸部分合并從而將它們分別污染稀釋。為去除這些殘留細(xì)胞以及避免/減少上述問題，眾所周知以較高速度執(zhí)行第二離心步驟。然而，再次，這樣強(qiáng)大的離心機(jī)往往在獲得血液的設(shè)施無法使用。此外，即使抽血后直接得到血漿，如果不能直接分離核酸，建議在-80℃冷凍以保存其內(nèi)包含的核酸。這也給必須冷凍運(yùn)輸?shù)臉颖救缪獫{樣本的處理強(qiáng)加實(shí)際限制。這增加成本，而且在冷鏈被中斷的情況下存在樣本被破壞的風(fēng)險。對于血液固定化，以下技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的：血液樣本通常收集在含有噴霧干燥或液體EDTA(如BD真空采血管(Vacutainer)K2EDTA)的血液收集管內(nèi)。EDTA螯合鎂，鈣和其它二價金屬離子，從而抑制酶反應(yīng)，如例如血液凝結(jié)或由于DNA酶的DNA降解。然而，EDTA不能有效防止儲存期間胞外核酸群被釋放的胞內(nèi)核酸分別地稀釋污染。因此，EDTA固定樣本的無細(xì)胞部分中發(fā)現(xiàn)的胞外核酸群在儲存期間改變，且被大量胞內(nèi)核酸，特別是基因組DNA污染。因此，特別地，EDTA不能充分固定胞外細(xì)胞群，因?yàn)樗荒鼙苊獍饧?xì)胞群被如取血后由細(xì)胞降解和樣本運(yùn)輸和存儲期間細(xì)胞不穩(wěn)定產(chǎn)生的基因組DNA片段污染。已知血液收集管包含用于在樣本收集點(diǎn)直接固定RNA基因表達(dá)譜和由此的轉(zhuǎn)錄組的試劑(參見例如US 6,617,170、US 7,270,953、Kruhoffer等,2007)。但是，這些方法是基于包含在樣本中的細(xì)胞的立即裂解。因此，這些方法和誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的其他方法不適合固定含細(xì)胞樣本中的胞外核酸群，因此它們誘導(dǎo)胞內(nèi)核酸釋放，從而與胞外核酸群混合。此外，現(xiàn)有技術(shù)已知用于固定含細(xì)胞樣本，如血液或組織樣本的方法，其固定如細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄組、基因組和蛋白質(zhì)組。這樣的方法在如WO 2008/145710中公開。所述方法基于使用特定固定化合物，如，例如N,N-二甲基乙酰胺。但是N,N-二甲基乙酰胺是有毒試劑。因此，需要提供避免使用有毒試劑的其他固定方法。專門著眼于固定包含在全血中的胞外核酸的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。一本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于固定包含在含細(xì)胞生物樣本中的胞外核酸群的方法，包括將所述含細(xì)胞生物樣本與作為固定劑的至少一種聚氧乙烯聚合物或作為固定劑的乙二醇接觸的步驟。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.03.18 EP 14000990.3;2014.03.18 US 61/955,2001.一種用于固定包含在含細(xì)胞生物樣本中的胞外核酸群的方法，包括將所述含細(xì)胞生物樣本與作為固定劑的至少一種聚氧乙烯聚合物或作為固定劑的乙二醇接觸的步驟。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物為聚乙二醇。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物為分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量在選自下組的范圍內(nèi)：1500-50000、2000-40000、2500-30000、2500-25000、3000–20000和3500–15000。5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，在所述含細(xì)胞生物樣本與所述高分子量聚氧乙烯聚合物以及任選的用于固定的其他助劑接觸后，得到的混合物包括濃度范圍選自下組的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.05％-4％(w/v)、0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)，或選自下組：0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)。6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物的分子量低于1500，優(yōu)選為分子量為1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物為分子量為1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，且優(yōu)選地，分子量在選自下組的范圍：100-800、150-700、200–600和200–500。8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，在所述含細(xì)胞生物樣本與所述聚氧乙烯聚合物以及任選的用于固定的其他助劑接觸后，得到的混合物包括聚氧乙烯聚合物，如分子量為1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，濃度范圍選自下組：0.5％-10％、1.5％-9％、2％-8％、2-7％、2.5％-7％和3％-6％。9.如權(quán)利要求3-8中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述含細(xì)胞生物樣本與分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物和分子量為1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物接觸。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在所述含細(xì)胞生物樣本與所述高分子量聚氧乙烯聚合物以及任選的用于固定的其他助劑接觸后，得到的混合物包括：-高分子量聚氧乙烯聚合物，濃度范圍選自下組：0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)；或選自下組：0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)；和-低分子量聚氧乙烯聚合物，濃度范圍選自下組：0.5％-10％、1.5％-9％、1.75％-8％、2％-7％和2.5％-6％。11.如權(quán)利要求1-10中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述含細(xì)胞生物樣本為血液，且其中所述血液樣本還與抗凝劑，優(yōu)選螯合劑接觸。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述血液樣本與高分子量聚氧乙烯聚合物、低分子量聚氧乙烯聚合物和抗凝劑接觸，其中，所述高分子量聚氧乙烯聚合物分子量處于選自下組的范圍：3000-40000、2500–25000和4000–20000；所述低分子量聚氧乙烯聚合物分子量處于選自下組的范圍：200-800、200–600和200–500，其中，在所述血液樣本與所述高和低分子量聚氧乙烯聚合物、抗凝劑以及任選的用于固定的其他助劑接觸后，得到的混合物包括濃度范圍為2％-7％，優(yōu)選為2.25％-6％的低分子量聚氧乙烯聚合物和濃度范圍選自下組的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.2％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)和0.4(w/v)-0.75％(w/v)。13.如權(quán)利要求1-12中一項或多項所述的方法，其特征在于，為固定，所述包含細(xì)胞的樣本還與作為固定劑的至少一種半胱天冬酶抑制劑和/或一種或多種伯、仲或叔酰胺接觸。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述伯、仲或叔酰胺為式1所示的化合物其中，R1是氫或烷基，優(yōu)選為C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更優(yōu)選C1-C2烷基；R2和R3相同或不同，選自氫和烴基，優(yōu)選烷基，具有1-20個原子的碳鏈長度，以直鏈或支鏈形式；和R4是氧、硫或硒，優(yōu)選地R4是氧。15.如權(quán)利要求1-14中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述包含細(xì)胞的樣本與丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺接觸，其中所述N,N-二烷基丙酰胺優(yōu)選為N,N-二甲基丙酰胺。16.如權(quán)利要求1-15中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述含細(xì)胞生物樣本，其優(yōu)選是血液樣本或源自血液的樣本如血漿或血清，與下組接觸：a)至少一種高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500，優(yōu)選為2000–40000，更優(yōu)選2000-30000、2500–25000或3000-20000；b)一種或多種式1所示的化合物，優(yōu)選地濃度使得與含細(xì)胞生物樣本的混合物中的濃度范圍為0.25％-5％、0.3％-4％、0.4％-3％、0.5％-2％或0.75％-1.5％；c)至少一種半胱天冬酶抑制劑，優(yōu)選泛半胱天冬酶抑制劑，更優(yōu)選Q-VD-Oph，優(yōu)選地濃度使得與含細(xì)胞生物樣本的混合物中的半胱天冬酶抑制劑的濃度范圍為0.1μM-20μM，更優(yōu)選0.5μM-10μM，更優(yōu)選1μM-10μM，更優(yōu)選3μM-7.5μM；d)任選的至少一種其他聚氧乙烯聚合物，其分子量低于使用的所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量至少100、優(yōu)選至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物優(yōu)選是低分子量聚氧乙烯，其分子量為1000或更低，優(yōu)選分子量為200-800或200-600；e)任選的螯合劑，更優(yōu)選EDTA。17.如權(quán)利要求14-16中一項或多項所述的方法，其特征在于，為固定，所述包含細(xì)胞的樣本，其優(yōu)選為血液樣本，與下組接觸：a)至少一種高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少3000；b)一種或多種式1所示的化合物；c)至少一種半胱天冬酶抑制劑；d)任選至少一種低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量為1000或更低；e)任選地螯合劑，優(yōu)選EDTA，其中，由于固定，減少了從包含在包含細(xì)胞的樣本內(nèi)的細(xì)胞釋放基因組DNA進(jìn)入樣本的無細(xì)胞部分。18.如權(quán)利要求1-17中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述包含細(xì)胞的樣本為血液樣本，其與下組接觸：a)至少一種高分子...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·哥爾茲，
申請(專利權(quán))人：凱杰有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：德國;DE