1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其編碼基因與應用制造技術

本發明專利技術公開了1?脫氧?D?木酮糖?5?磷酸合成酶及其編碼基因與應用。本發明專利技術所提供的1?脫氧?D?木酮糖?5?磷酸合成酶是如下a)或b)的蛋白質：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有1?脫氧?D?木酮糖?5?磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白質。本發明專利技術獲得了一個編碼1?脫氧?D?木酮糖?5?磷酸合成酶的新基因Rsdxs。重組1?脫氧?D?木酮糖?5?磷酸合成酶蛋白具有較高的酶活性，和很好的應用前景及開發價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其編碼基因與應用。
技術介紹
萜類化合物是以異戊二烯為結構單位的一類化合物，在自然界生命活動中扮演重要的作用，眾多萜類化合物如胡蘿卜素、青蒿素(Artemisinin)、紫杉醇(Taxol)、人參皂苷(Ginsenoside)等具有重要的工業及醫藥應用價值。還有一些化合物是重要的工業原料，如多萜化合物橡膠是汽車和飛機工業的重要原料。自然界中萜類化合物大多數只是生物合成中間體，含量很低且分離純化操作復雜。化學合成法工藝復雜，收率低，成本高，毒性大，大大限制了萜類化合物的應用。隨著萜類化合物生物合成途徑的闡明，利用微生物代謝工程生產萜類化合物成為廉價而高效的方法。所有萜類化合物都來自于兩種5碳前體：異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP和DMAPP通過聚合反應產生不同的萜類化合物。5碳前體的合成有兩條途徑：甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP)途徑。MVA途徑主要存在于古生菌、真菌、植物的細胞液或內質網上，MEP途徑主要存在于細菌和植物質體中。甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑生產異戊二烯的理論轉化率為25.2％，2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP)途徑生產異戊二烯的理論轉化率為30.2％。MEP途徑由于其具有更強的生產優勢，自發現以來便受到了國內外科學家的廣泛關注并取得了顯著研究進展。該途徑由8步連續反應催化，將底物丙酮酸和3-磷酸-甘油醛轉化為異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。第一步反應是由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(Dxs)催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合生成1-脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)。該步驟是萜類物質合成的第一個限速步驟，許多研究表明Dxs的過量表達可以促進IPP&DMAPP及下游各種萜類化合物的積累，是MEP代謝途徑中最重要的遺傳操作靶位點。因此如何獲得性質優良的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶對萜類化合物的生產非常重要。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其編碼基因。本專利技術所提供的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶，名稱為RsDxs，來源于類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)，是如下a)或b)的蛋白質：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白質。本專利技術所提供的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的編碼基因，為如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由1914個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質。序列表中序列2由637個氨基酸殘基組成。含有所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的編碼基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌也屬于本專利技術的保護范圍。所述重組載體中啟動所述基因轉錄的啟動子為araBAD啟動子。將Rsdxs基因克隆到原核表達載體pSB1s上，得到的重組載體核苷酸序列是序列表中序列3。所述重組菌為將所述編碼基因導入宿主菌得到的重組菌；所述編碼基因是通過所述的重組載體導入宿主菌中的；所述宿主菌為大腸桿菌BW25113或BW25113Δpgi PT5-idi。擴增所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本專利技術的保護范圍。所述蛋白質、所述編碼基因、所述重組載體或所述表達盒、轉基因細胞系或重組菌在制備萜類化合物中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術以類球紅細菌總DNA為模板，用PCR擴增獲得一個編碼1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的新基因Rsdxs。將Rsdxs基因克隆到原核表達載體pSB1s上，在大腸桿菌中進行1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶蛋白(RsDxs)的高效表達。獲得的重組1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶蛋白可以催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，具有較高的酶活性，具有較高的應用前景及開發價值。附圖說明圖1為Rsdxs的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為重組載體pSB1s-Rsdxs的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為基因工程菌pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI表達產
物的SDS-PAGE分析圖。圖4為基因工程菌pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI的鏈孢紅素產物的特征吸收峰442nm峰值柱狀圖。具體實施方式下面結合具體實施方式對本專利技術進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本專利技術，而不是為了限制本專利技術的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中，大腸桿菌BW25113(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry LWanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)是一株非病原菌，遺傳背景清楚，世代時間短、容易培養且培養基原料低廉。大腸桿菌BW25113公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復本專利技術的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，CGMCC 1.1737。本專利技術所提供的宿主菌，為對大腸桿菌BW25113進行A1和A2改造得到，得到的宿主菌命名為BW25113Δpgi PT5-idi(簡稱PI)。所述A1為將所述宿主菌的磷酸葡萄糖異構酶(pgi)基因敲除(參考Huaiwei Liu,Yuanzhang Sun,Kristine Rose M.Ramos,Grace M.Nisola,Kris Nin～oG.Valdehuesa,Won–Keun Lee,Si Jae Park,Wook-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有1?脫氧?D?木酮糖?5?磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白質。

【技術特征摘要】
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白質。2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因為如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張莎莎，韓莉，劉偉豐，江賢章，陶勇，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11