本發明專利技術公開了一種腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物及檢測方法，引物的序列為：CODEHOP外引物序列和CODEHOP內引物序列以及20種病毒的引物序列。檢測方法包括：RNA的提取；一步RT?PCR；巢式PCR；用1.5％濃度瓊脂糖凝膠電泳，判定腸道病毒陽性和分型結果。本發明專利技術設計了一對腸道病毒屬一致?簡并引物，并在該引物擴增片段內部，設計了一對短片段的一致?簡并引物和20種不同腸道病毒的分型引物，結合巢式RT?PCR技術技術，建立了可用于腸道病毒屬的不同基因型病毒篩查和分型的簡并引物巢式RT?PCR方法，具有靈敏度高、特異性強，適用于低病毒含量樣品的腸道病毒監測和種類鑒定的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程
，尤其涉及一種腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物及檢測方法。
技術介紹
近年來，由腸道病毒感染爆發人傳染病流行常有報道，已經成為重要的公共衛生問題；腸道病毒(Enterovirus)屬于微小RNA病毒科(Picornaviridae)K屬，已知有64種血清型會感染人體，包括脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒和一些新型腸道病毒和甲型肝炎病毒等。比如1998年臺灣地區爆發了由腸道病毒71型(EV71)感染的手足口病和皰疹性咽呷炎流行，感染人數超過10萬，幾百人因并發腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫和出血、急性弛緩性麻痹和心肌炎而死亡。目前在無菌性腦膜炎的致病因子中HEV約占80％～92％。近年還有一些研究表明糖尿病也與腸道病毒有關。病人和感染動物所攜帶的腸道病毒會通過糞便污染水環境、食物和土壤進行傳報播，因此加強排泄物和外環境樣品監測，是開展腸道病毒風險評估和采取有效控制手段的重要依據。現有的腸道病毒的檢測技術，主要有兩類：一個是傳統的生物學方法，如細胞培養法，該方法成本高、費時、操作繁瑣、易污染，作為病原體的快速篩查手段不是很理想；另一個是以PCR技術為代表的分子生物學技術，具有快速、靈敏、成本低等優勢，但是現有的PCR及其衍生技術，通常為采用特定病毒種類的引物，對于未知型別的病毒易漏檢。近來也有一些摸索通用引物對于腸道病毒檢測的報道，所采用的引物設計區域為5`端非編碼區域，該區域高度保守無法用于病毒分型。另外，普通PCR技術對于低病毒含量的樣品靈敏度不夠容易造成假陰性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物及檢測方法，旨在解決現有的腸道病毒的檢測技術存在成本高、費時、操作繁瑣、易污染，對于未知型別的病毒易漏檢，無法用于病毒分型，樣品靈敏度不夠容易造成假陰性的問題。本專利技術是這樣實現的，一種腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物，所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的序列包括：CODEHOP外引物序列和CODEHOP內引物序列以及20種病毒的引物序列；CODEHOP外引物序列SEQ ID NO：1；CODEHOP內引物序列SEQ ID NO：2；Enterovirus 71引物序列SEQ ID NO：3；Enterovirus B84引物序列SEQ ID NO：4；Enterovirus D68引物序列SEQ ID NO：5；Echovirus E6引物序列SEQ ID NO：6；Coxsackievirus A16引物序列SEQ ID NO：7；Coxsackievirus A8引物序列SEQ ID NO：8；Coxsackievirus B2引物序列SEQ ID NO：9；Coxsackievirus B3引物序列SEQ ID NO：10；Coxsackievirus A12引物序列SEQ ID NO：11；Coxsackievirus_B4引物序列SEQ ID NO：12；Coxsackievirus A6引物序列SEQ ID NO：13；Coxsackievirus A4引物序列SEQ ID NO：14；Coxsackievirus A24引物序列SEQ ID NO：15；Coxsackievirus A10引物序列SEQ ID NO：16；Human poliovirus 1引物序列SEQ ID NO：17；Rhinovirus C引物序列SEQ ID NO：18；Human echovirus 19引物序列SEQ ID NO：19；Human enterovirus 70引物序列SEQ ID NO：20；Porcine enterovirus 9引物序列SEQ ID NO：21；Possum enterovirus W1引物序列SEQ ID NO：22。本專利技術的另一目的在于提供一種所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：步驟一，RNA的提取：使用RNA提取試劑盒提取RNA；步驟二，第一步RT-PCR反應：采用一步法RT-PCR試劑盒進行反應，反應體系為50μL,RNase Free Water 19μL，5×RT-PCR Buffer 10μL，10mM dNTP Mixture 2μL，Enzyme Mix 2μL，Ribonuclease Inhibitor 1μL，20μM上游CODEHOP外引物2μL，下游CODEHOP外引物4μL，RNA模板10μL。反應程序為60℃1min，42℃10min，50℃30min，95℃15min反轉錄結束后，94℃30s，52℃30s，72℃1min，35個循環，72℃7min，PCR產物4℃保存，作為巢式PCR模板。步驟三，巢式PCR：20μL的反應體系，10×PCR擴增緩沖液2μl，25mmol/L的MgCl21.2μl，10mmol/L dNTPs 0.4μl，20μmol/L CODEHOP上下游內引物或分型引物各0.4μl，5U/μl Taq聚合酶0.4μl，一步RT-PCR反應產物模板1μl，無菌雙蒸水補足體積至20μl。反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環，72℃延伸10min；步驟四，用1.5％濃度瓊脂糖凝膠電泳，判定腸道病毒陽性和分型結果。本專利技術的另一目的在于提供一種應用所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的排泄物中腸道病毒群各種型別病毒篩查及主要基因型別檢測方法。本專利技術的另一目的在于提供一種應用所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的水中腸道病毒群各種型別病毒篩查及主要基因型別檢測方法。本專利技術的另一目的在于提供一種應用所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的土壤中腸道病毒群各種型別病毒篩查及主要基因型別檢測方法。本專利技術提供的腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物及檢測方法，公開了一種 快速檢測外環境樣品包括排泄物、水、土壤中腸道病毒群各種型別病毒篩查及主要基因型別檢測的方法；通過依據腸道病毒屬各種病毒共有的蛋白質氨基酸序列設計腸道病毒屬一致-簡并引物，并在該引物擴增片段內部，設計了一對短片段的一致-簡并引物和20種不同腸道病毒的分型引物，結合巢式RT-PCR技術技術，建立了可用于腸道病毒屬的不同基因型病毒篩查和分型的簡并引物巢式RT-PCR方法，具有靈敏度高、特異性強，適用于低病毒含量樣品的腸道病毒監測和種類鑒定的特點。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的檢測方法流程圖。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。本專利技術實施例的腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的序列包括：CODEHOP外引物序列和CODEHOP內引物序列以及20種病毒的引物序列。CODEHOP外引物序列SEQ ID NO：1：E4559：CAGATCCAGATCATTTTGATGGATAYRANCARCAFE5803：CATTGTCCTGCTCTTGTTGGAWARTTRTAYWTCODEHOP內引物序列SEQ ID NO：2:E4559：CAGATCCAGATCATTTTG本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物，其特征在于，所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的序列包括：CODEHOP外引物序列和CODEHOP內引物序列以及20種病毒的引物序列；CODEHOP外引物序列SEQ?ID?NO：1；CODEHOP內引物序列SEQ?ID?NO：2；Enterovirus?71引物序列SEQ?ID?NO：3；Enterovirus?B84引物序列SEQ?ID?NO：4；Enterovirus?D68引物序列SEQ?ID?NO：5；Echovirus?E6引物序列SEQ?ID?NO：6；Coxsackievirus?A16引物序列SEQ?ID?NO：7；Coxsackievirus?A8引物序列SEQ?ID?NO：8；Coxsackievirus?B2引物序列SEQ?ID?NO：9；Coxsackievirus?B3引物序列SEQ?ID?NO：10；Coxsackievirus?A12引物序列SEQ?ID?NO：11；Coxsackievirus_B4引物序列SEQ?ID?NO：12；Coxsackievirus?A6引物序列SEQ?ID?NO：13；Coxsackievirus?A4引物序列SEQ?ID?NO：14；Coxsackievirus?A24引物序列SEQ?ID?NO：15；Coxsackievirus?A10引物序列SEQ?ID?NO：16；Human?poliovirus?1引物序列SEQ?ID?NO：17；Rhinovirus?C引物序列SEQ?ID?NO：18；Human?echovirus?19引物序列SEQ?ID?NO：19；Human?enterovirus?70引物序列SEQ?ID?NO：20；Porcine?enterovirus?9引物序列SEQ?ID?NO：21；Possum?enterovirus?W1引物序列SEQ?ID?NO：22。...
【技術特征摘要】
1.一種腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物，其特征在于，所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的序列包括：CODEHOP外引物序列和CODEHOP內引物序列以及20種病毒的引物序列；CODEHOP外引物序列SEQ ID NO：1；CODEHOP內引物序列SEQ ID NO：2；Enterovirus 71引物序列SEQ ID NO：3；Enterovirus B84引物序列SEQ ID NO：4；Enterovirus D68引物序列SEQ ID NO：5；Echovirus E6引物序列SEQ ID NO：6；Coxsackievirus A16引物序列SEQ ID NO：7；Coxsackievirus A8引物序列SEQ ID NO：8；Coxsackievirus B2引物序列SEQ ID NO：9；Coxsackievirus B3引物序列SEQ ID NO：10；Coxsackievirus A12引物序列SEQ ID NO：11；Coxsackievirus_B4引物序列SEQ ID NO：12；Coxsackievirus A6引物序列SEQ ID NO：13；Coxsackievirus A4引物序列SEQ ID NO：14；Coxsackievirus A24引物序列SEQ ID NO：15；Coxsackievirus A10引物序列SEQ ID NO：16；Human poliovirus 1引物序列SEQ ID NO：17；Rhinovirus C引物序列SEQ ID NO：18；Human echovirus 19引物序列SEQ ID NO：19；Human enterovirus 70引物序列SEQ ID NO：20；Porcine enterovirus 9引物序列SEQ ID NO：21；Possum enterovirus W1引物序列SEQ ID NO：22。2.一種如權利要求1所述腸道病毒屬病毒篩查和分型的引物的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：步驟一，RNA的提取：使用RNA提取試劑盒提取RNA；步驟二，一步RT-PCR：采用一步法RT-PCR...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡群，王軍，馬思杰，裘炯良，童淑梅，鄒春穎，倪紅霞，
申請(專利權)人：中華人民共和國大榭出入境檢驗檢疫局，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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