本發明專利技術公開了一種改造的克雷伯氏肺炎桿菌及其生產葡萄糖酸的應用。該改造的克雷伯氏肺炎桿菌為葡萄糖酸脫氫酶失活的克雷伯氏肺炎桿菌。通過將克雷伯氏肺炎桿菌中葡萄糖酸脫氫酶的編碼基因進行失活來獲得所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌。利用所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌生產葡萄糖酸，具有較高的底物轉化率，較高的生產強度和較高的產物終濃度。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于菌株的基因工程改造
，具體涉及改造的克雷伯氏肺炎桿菌及其生產葡萄糖酸的應用。
技術介紹
葡萄糖酸是一種重要的大宗有機酸，葡萄糖酸金屬鹽廣泛應用于保健食品領域作為補充鈣、鐵、鋅等元素的補充劑。葡萄糖酸鹽還是重要的藥品，應用于多種病癥治療。葡萄糖酸及其鹽具有很好的螯合作用，應用于冷卻用水等的緩蝕阻垢。葡萄糖酸及其鹽作為除垢劑用于鋼鐵和玻璃等表面清洗。葡萄糖酸及其鹽應用到混凝土是一種很好的緩凝劑，增加混凝土的可塑性和強度。葡萄糖酸還是土壤中解磷微生物解磷的主要代謝產物，葡萄糖酸與土壤中的鈣離子結合，而釋放出磷酸根，供給植物磷源。葡萄糖酸生產多數以葡萄糖為原料通過化學或生物方法生產。化學法生產葡萄糖酸可以通過化學氧化劑，如雙氧水等在貴催化劑的催化下進行氧化。葡萄糖為原料通過電化學氧化也可以生產葡萄糖酸。也有報道在超聲波作用下利用碘氧化葡萄糖生產葡萄糖酸。葡萄糖酸可以通過生物法進行生產，多種微生物可以代謝葡萄糖生成葡萄糖酸，其中葡萄糖酸生產能力比較高的主要是黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)和氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)等。目前在我國工業上主要是利用黑曲霉發酵葡萄糖生產葡萄糖酸。克雷伯氏肺炎桿菌是一種重要的工業微生物，可用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生產。一般生物體中細胞外的葡萄糖通過細胞膜上磷酸烯醇式丙酮酸依賴的轉運系統進入胞內，同時磷酸化形成磷酸葡萄糖，在胞內代謝生產各種代謝終產物，并產生能量。克雷伯氏肺炎桿菌在好氧條件下利用葡萄糖為原料主要合成2,3-丁二醇和乙酸、琥珀酸、乳酸等有機酸。但是在酸性條件下培養，克雷伯氏肺炎桿菌可以積累高水平的2-酮基
葡萄糖酸。具體內容參見申請號為201310012784的中國專利技術專利。
技術實現思路
本專利技術的目的是，提供一種改造的克雷伯氏肺炎桿菌及其生產葡萄糖酸的應用。本專利技術為實現上述目的所采用的技術方案如下：一種改造的克雷伯氏肺炎桿菌，該改造的克雷伯氏肺炎桿菌為位于周質空間內膜上的葡萄糖酸脫氫酶失活的克雷伯氏肺炎桿菌。所述葡萄糖脫氫酶是指位于細胞周質空間的葡萄糖酸脫氫酶，催化周質空間的葡萄糖酸氧化生成2-酮基葡萄糖酸。該酶蛋白由兩個亞基組成，兩個亞基的編碼基因相鄰，其在克雷伯氏肺炎桿菌342中小亞基的基因閱讀框如SEQ ID NO.1所示，Genebank編號為(gene ID 6937950)；大亞基的基因閱讀框如SEQ ID NO.2所示，Genebank編號為(gene ID 6934738)。所述葡萄糖酸脫氫酶的失活通過葡萄糖酸脫氫酶大亞基基因和/或小亞基基因失活來實現。利用基因重組方法對葡萄糖酸脫氫酶基因大亞基基因和小亞基基因中的一個基因進行失活或兩個基因同時進行失活，從而構建獲得所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌。本專利技術還提供了所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌在生產葡萄糖酸中的應用。本專利技術還提供了所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌生產葡萄糖酸的方法，該方法為：將改造的克雷伯氏肺炎桿菌接種到以葡萄糖為碳源的培養基中，進行好氧發酵培養。優選地，所述發酵培養基的組成包括：葡萄糖5-300g/L，氮源0.5-50g/L，無機鹽0-10g/L。所述氮源選自玉米漿、酵母提取物、蛋白胨、豆餅粉、尿素、氨、銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽；所述無機鹽選自鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽。優選地，所述好氧發酵條件為：將菌株接種到發酵培養基，發酵溫度25-45℃，保持發酵過程中溶解氧濃度大于飽和溶氧的1％，保持發酵過程中
發酵液的pH值在3.5-6.0之間。進一步優選地，所述好氧發酵條件為：將菌株接種到發酵培養基，發酵溫度30-40℃，保持發酵過程溶解氧濃度大于飽和溶氧的20％，保持發酵過程中發酵液的pH值在4-5.5之間。優選地，所述的改造的克雷伯氏肺炎桿菌生產葡萄糖酸的方法還包括：發酵過程中待葡萄糖消耗至1-20g/L時流加高濃度葡萄糖進行補料發酵。相對于現有技術，本專利技術的有益效果為：本專利技術通過葡萄糖酸脫氫酶失活對克雷伯氏肺炎桿菌進行改造，改造后的克雷伯氏肺炎桿菌利用葡萄糖為碳源進行發酵培養時，葡萄糖在周質空間氧化形成葡萄糖酸以后，在發酵液中積累。本專利技術提供的方法，葡萄糖轉化成葡萄糖酸的轉化率高，產物終濃度高，生產強度大，可用于工業化生產。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術的技術方案進行詳細說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業化產品。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業化產品。實施例1利用基因重組方法對克雷伯氏肺炎桿菌葡萄糖酸脫氫酶基因小亞基進行失活，來實現葡萄糖脫氫酶活性失活。本實施例中的克雷伯氏肺炎桿菌采用保藏號為CGMCC 1.6366的菌株(該菌株也稱為TUAC01)，其保藏地址為：為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏。該保藏號為CGMCC 1.6366的菌株已經在授權專利技術專利ZL201310346916.8中公開，另外在公開文獻(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:12191226)中也已經公開該菌株。該菌株是一株用于生產1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。該菌分離自土壤，分離過程及性狀描述見(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of
Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌葡萄糖酸脫氫酶基因序列，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。克雷伯氏肺炎桿菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎桿菌，其全基因組已經測序，并且提交到了genebank。根據克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設計乙偶姻脫氫酶系及調控基因PCR引物，上游引物gad-s：GGGCCAGACGCTAAGCGGTTTGAAAGCGCA(SEQ ID NO.3所示)，下游引物gad-a：AACCATTGCATTTTCATCATCTGCCTTCCT(SEQ ID NO.4所示)。通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得葡萄糖酸脫氫酶小亞基基因大亞基基因以及相鄰片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質粒(商業產品)上，得到的重組質粒命名為pMD18T-gad質粒，該重組質粒上連接的來自克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366的葡萄糖酸脫氫酶小亞基、大亞基基因及相鄰片段的序本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種改造的克雷伯氏肺炎桿菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌為位于周質空間內膜上的葡萄糖酸脫氫酶失活的克雷伯氏肺炎桿菌。
【技術特征摘要】
1.一種改造的克雷伯氏肺炎桿菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌為位于周質空間內膜上的葡萄糖酸脫氫酶失活的克雷伯氏肺炎桿菌。2.如權利要求1所述的改造的克雷伯氏肺炎桿菌，其特征在于：所述葡萄糖酸脫氫酶的失活通過葡萄糖酸脫氫酶大亞基基因和/或小亞基基因失活來實現。3.如權利要求2所述的改造的克雷伯氏肺炎桿菌，其特征在于：所述葡萄糖酸脫氫酶大亞基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖酸脫氫酶小亞基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.權利要求1-3任一項所述的改造的克雷伯氏肺炎桿菌在生產葡萄糖酸中的應用。5.權利要求1-3任一項所述的改造的克雷伯氏肺炎桿菌生產葡萄糖酸的方法，該方法為：將所述改造的克雷伯氏肺炎桿菌接種到以葡萄糖為碳源的培養基中，進行好氧發酵培養生產葡萄糖酸。6.如權利要求5所述的改造的克雷伯氏肺炎桿菌生產葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述發酵培養基的組成包括：葡萄糖5-300g/L，氮源0.5-50g/L...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郝健，王德信，魏東，柳鵬福，史吉平，姜標，王晨紅，
申請(專利權)人：中國科學院上海高等研究院，
類型：發明
國別省市：上海;31
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