一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法技術

本發明專利技術公開了一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法，該粗酶液能夠一步水解新橙皮苷或橙皮苷β-D-葡萄糖苷鍵，制得相應的苷元橙皮素。其步驟包括：發酵制備Penicillium?decumbens的粗酶液，通過調整該粗酶液含量及反應時間，可以將新橙皮苷或橙皮苷直接轉化為橙皮素，轉化液通過有機溶劑溶解或萃取，色譜分離純化得到橙皮素。本方法能夠克服傳統化學方法制備橙皮素反應條件苛刻、污染嚴重、轉化率低等缺點，以及直接采用微生物發酵造成的操作繁瑣、產物不單一、產物純化困難等不足之處。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程領域，具體涉及一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法。
技術介紹
傳統藥用資源橘皮，又稱為陳皮，具有祛痰、平喘，降血壓，抗菌，抗炎，抗氧化等藥理作用。橘皮中除了含有精油以外，還含有大量的黃酮類化合物，研究表明，橘皮中的黃酮類化合物是其發揮抗炎、抗氧化等藥理活性的主要相關因素。橘皮中黃酮類化合物成分復雜，目前已經從橘皮中分離到了60多種黃酮類化合物，其中比較常見的有橘皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川皮素、柚皮苷、柚皮蕓香甘等。新橙皮苷和橙皮苷因其含量高，藥理活性突出等優點，來源廣泛，在當前的研究中得到了更普遍的關注。其藥理活性包括抗肝癌細胞擴增、抑制小鼠因感染引起的內毒素休克、抗過敏、抗雌激素、保護神經系統、抗氧化、自由基清除以及潛在的胃腸道保護作用等等。但有研究證實新橙皮苷或橙皮苷會被腸道菌的水解代謝，釋放出其苷元橙皮素，而橙皮素具有更廣泛的藥理活性，其抗炎活性要高于糖苷本身，因此兩者口服后發揮藥效的基礎可能是橙皮素。如何通過含量較高糖苷水解制備含量較低的苷元，以闡明其發揮活性作用的物質基礎，或將低價值的成分轉為高價值的成分，在食品和藥學領域都成為橘皮資源研究的熱門。目前水解轉化糖苷類化合物常用的方法有化學法和生物法。在新橙皮苷或橙皮苷的研究中，多采用酸水解法，如美國專利US4150038中利用濃硫酸等在低碳醇的作用下水解橙皮苷產生橙皮素。此外還有很多文獻報道生成橙皮素的
方法，如水相法、水相-乙醇法、甲醇法、環己醇法等，但這些方法都會涉及到工藝繁瑣、污染嚴重、產物純化困難等其中部分缺點。利用微生物發酵法進行生物轉化也是一種常見的方法。Zhang Wei等利用Clostridium sp.8,Bacteroides sp.15,Bacillus sp.46,Enterobacter sp.41-1和sp.73等五株腸道菌的發酵液催化新橙皮苷轉化，得到水解產物、脫羥基、脫甲基以及乙酰化產物。盡管微生物發酵法反應條件溫和、反應效率高、環境污染小，但反應產物種類多樣、成分復雜，不僅影響收率，對于純化分離也造成了更大的困難。酶促水解反應也是一種生物轉化的常用手段，糖苷酶可以選擇性的識別不同種類或不同構型的糖苷鍵，以定向地水解相應的糖苷鍵。其主要特點為轉化效率高、反應專一性強、條件溫和易實現，排除了后期繁瑣的分離過程。因此通過尋找經濟高效、專一穩定的工具酶來定向地進行生物轉化，獲得所需要的目標化合物也逐漸成為現代研究的重要突破點。盡管一步水解制備橙皮素的實例較為缺乏，但通過篩選合適的工具酶和反應條件，獲得更高含量、高活性的苷元仍是值得去探索的領域。
技術實現思路
本專利技術提供了一種通過酶法水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法。一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法，按照以下步驟進行：1)采用Penicillium decumbens(斜臥青霉)發酵產生的高α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的粗酶液，在緩沖液中選擇性的水解新橙皮苷或橙皮苷，使其轉化為橙皮素，具體方法為，取20-50mg的新橙皮苷或橙皮苷置于反應釜中，按照10：1：0.1的體積比依次加入緩沖液、粗酶液和激活劑后共同孵育；2)橙皮素的制備：待反應結束后，將上述轉化液與等倍體積的甲醇混合，離心后取上清，于40-50℃減壓濃縮后溶于0.5倍體積的甲醇，過制備型色譜柱即得到橙皮素。所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、或檸檬酸緩沖液；所述的激活劑為：CaCl2溶液。所述步驟1)中:反應體系中激活劑濃度為5-20mM，緩沖液的pH值為5.5-7.0，水解反應溫度為20-40℃，反應時間為0.5-4h，離心條件為4℃下20000g離心20min。所述步驟2)中處理沉淀的有機溶劑為甲醇、乙醇或丙酮。上述粗酶液處理新橙皮苷或橙皮苷后，使得二糖苷一步轉化為苷元，轉化率達到98％以上。本專利技術提供了一種利用工具酶高效高選擇性轉化新橙皮苷或橙皮苷，制備更高應用價值的代謝產物的方法，轉化率可達到98％以上，最終收率可達95％。與其他方法相比，該方法轉化效率高、反應專一性強、條件溫和易實現，產物純度高，縮減了后期繁瑣的分離過程。附圖說明圖1為酶解新橙皮苷制備橙皮素的液相轉化圖，反應時間為4h，新橙皮苷完全轉化。圖2為酶解橙皮苷制備橙皮素的液相轉化圖，反應時間為4h，橙皮苷完全轉化。具體實施方式本專利技術通過下列實施例對本專利技術
技術實現思路
予以進一步闡明，其目的僅僅為了更好理解本專利技術，而不是限制本專利技術權利要求的保護范圍。實施例需要體現
權利要求中范圍的上限、下限和中間值，至少還需要添加一個實施例。將權利要求中的激活劑等具體物質代入實施例中。實施例1粗酶液的制備使用含有3％的麥麩提取物，0.2％酵母提取物，1％葡萄糖，0.5％的KH2PO4，0.2％的(NH4)2SO4作為種子培養基，將上述種子培養基50ml分配到100ml錐形瓶中，在120℃滅菌15min，將Penicillium decumbens的瓊脂平板培養物接種到其中，并在30℃培養2天作為種子液。500ml Erlenmeyer培養瓶中放入100ml含5％玉米漿，0.2％酵母提取物，0.2％的KH2PO4，1％柚皮苷的培養基，PH4.5，高壓滅菌121度30min。將1ml種子液接種于此培養基，150rpm，25℃搖床培養5天。離心收集上清液，即為粗酶液。實施例2取100ml三角瓶依次加入20ml磷酸緩沖液(pH6.0)，3.5ml粗酶液，250ul濃度為20mM的激活劑，600ul濃度為80mM的新橙皮苷溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉式搖床反應4h，每隔1h取樣進行HPLC分析(檢測波長283nm，流動相為：乙腈(B)/純水(A)，梯度為，0-10min，25％-50％B；10.0-12.0min，50％-90％B；12.0-16.0min，90％-90％B，流速1ml/min)，新橙皮苷0.5h轉化率大于98％，反應4h后完全轉化。制備出的產品為橙皮素.如圖1所示，由圖1可以看出該粗酶液對新橙皮苷具有極高的轉化率。實施例3取100ml三角瓶依次加入20ml磷酸緩沖液(pH6.0)，3.5ml濃度為100mg/ml的酶溶液，250ul濃度為20mM的激活劑，600ul濃度為80mM的橙皮苷溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉式搖床反應4h，每隔1h取樣進
行HPLC分析(檢測波長283nm，流動相為：乙腈(B)/純水(A)，梯度為，0-10min，25％-50％B；10.0-12.0min，50％-90％B；12.0-16.0min，90％-90％B，流速1ml/min)，橙皮苷0.5h轉化率大于98％，反應4h后完全轉化。制備出的產品為橙皮素.如圖2所示，由圖2可以看出該粗酶液在轉化橙皮苷制備橙皮素方面具有很顯著的優勢。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法，其特征在于按照以下步驟進行：1)采用Penicillium?decumbens即斜臥青霉發酵產生的高α?鼠李糖苷酶和β?葡萄糖苷酶活性的粗酶液，在緩沖液中選擇性的水解新橙皮苷或橙皮苷，使其轉化為橙皮素，具體方法為:取20?50mg的新橙皮苷或橙皮苷置于反應釜中，按照10：1：0.1的體積比依次加入緩沖液、粗酶液和激活劑后共同孵育；2)橙皮素的制備：待反應結束后，將上述轉化液與等倍體積的甲醇混合，離心后取上清，于50℃減壓濃縮后溶于0.5倍體積的甲醇，過制備型色譜柱即得到橙皮素。

【技術特征摘要】
1.一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法，其特征在于按照以下步驟進行：1)采用Penicillium decumbens即斜臥青霉發酵產生的高α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的粗酶液，在緩沖液中選擇性的水解新橙皮苷或橙皮苷，使其轉化為橙皮素，具體方法為:取20-50mg的新橙皮苷或橙皮苷置于反應釜中，按照10：1：0.1的體積比依次加入緩沖液、粗酶液和激活劑后共同孵育；2)橙皮素的制備：待反應結束后，將上述轉化液與等倍體積的甲醇混合，離心后取上清，于50℃減壓濃縮后溶于0.5倍體積的甲醇，過制備型色譜柱即得到橙皮素。2.如權利要求1所述的一種通過酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法，其特征在于：所述緩沖液為磷...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊凌，崔攀，葛廣波，竇同意，王平，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：遼寧;21