本發明專利技術公開了一種檢測小反芻獸疫病毒抗原的免疫磁珠試劑盒及其用途，屬于生物技術領域。本發明專利技術所述的試劑盒包括兔抗PPRV?H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠、以PPRVM基因片段為靶點檢測小反芻獸疫病毒抗原的引物對，RT?PCR反應混合液及RNA聚合酶。所述引物對的序列分別如SEQ?ID?NO.1以及SEQ?ID?NO.2所示。本發明專利技術的提出克服了小反芻獸疫病毒抗原檢測過程中PPRV病原易降解，且病原RNA提取過程中使用的待檢毒液體積有限導致所提取的RNA無法達到RT?PCR檢測的最低要求，而出現假陰性結果的問題，為小反芻獸疫病毒抗原的檢測提供了一種有效的技術手段。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種免疫磁珠試劑盒及其用途，特別涉及一種用于檢測小反芻獸疫病毒抗原的免疫磁珠試劑盒及其用途，本專利技術屬于生物
技術介紹
小反芻獸疫(Peste des petits runinants，PPR)又稱羊瘟，主要感染小反芻獸，特別是山羊和綿羊高度易感，野生動物中也偶有發生，是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits runinants virus，PPRV)引起的一種嚴重的急性、烈性、高度接觸傳染性疾病，目前尚無感染人的報道，其發病率和死亡率最高均可達100％，世界動物衛生組(OIE)將其列為法定報告的動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病。《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》將其列為重點防范的13種外來動物疫病之一。目前，小反芻獸疫已經在全國大部分地區偶有發生，嚴重威脅著我國的動物衛生安全和我國畜牧業的發展，是需要嚴格采取強制預防控制和撲滅的動物疫病之一。免疫磁珠技術(Immunomagnetic beads,IMB)是一種以抗原抗體反應為基礎，以磁載體技術為媒介的新型診斷技術。由于其特有的快速、高效、低毒、特異性高、操作簡單等特點而在生物醫學領域得到廣泛的應用。Jacobsen利用免疫磁珠技術檢測單核細胞增生的李斯特氏菌，其敏感性可檢測到培養液中的3x104個菌，回收率為95％，在混合培養液中可以很好的去除非目的菌，且特異性良好。楊萬等建立了一種免疫磁珠分離技術聯合實時定量PCR快速定量檢測水中輪狀病毒的方法，并通過制備能夠分離水中輪狀病毒的特異免疫磁珠，成功用于水中輪狀病毒的檢測。顏小飛等采用免疫磁珠分離技術和阻抗測量技術聯用的方法，實現了對禽流感H5亞型病毒的特異性快速檢測。何靜云等利用特異性抗體包被磁珠，成功地從感染大鼠肝臟中富集和純化了泰澤氏病原體，研究結果表明，免疫磁珠分離技術可有效地分離和純化泰澤氏病原體，為血清學抗原檢查隱性感染提供了新思路。針對PPRV感染的常規檢測及診斷方法很多，而OIE規定的標準檢測方法為競爭ELISA和RT-PCR方法。其中競爭ELISA主要作為PPRV抗體的血清學檢測方法，由于無法區分鑒別疫苗免疫抗體和自然感染抗體，因此在PPRV的感染檢測中最終確診仍然需要配合PCR的抗原診斷來判斷是否發生PPRV感染。PPRV為單股負鏈RNA病毒，對外界環境敏感，50℃、30min或陽光照射下很快就會失活降解。由于無法在野外開展PCR檢測，因此在病料采集和保存過程中容易造成組織病料中病毒含量降低，以至于造成假陰性的檢測結果。M蛋白是PPRV主要結構蛋白之一，在成熟的病毒粒子從細胞內釋放的過程中起著關鍵作用，在缺失M蛋白的情況下，病毒將失去感染細胞的能力，并且目前針對PPRV M基因的檢測方法很少，本專利技術針對PPRV M基因設計引物用于PPRV的檢測，作為PCR方法檢測的靶標基因，結果發現本專利技術設計的引物敏感性高，特異性好，同時由于免疫磁珠的病毒富集作用，因此可以有效解決小反芻獸疫病毒抗原檢測中病毒含量低難以檢測的問題，可以有效的增加PCR方法的病原檢出效率。
技術實現思路
針對現有技術中存在的小反芻獸疫病毒抗原檢測過程中由于PPRV病原易降解，且病原RNA提取過程中使用的待檢毒液體積有限導致所提取的RNA無法達到RT-PCR檢測的最低要求，而出現假陰性結果的問題，本專利技術一方面設計了一對以PRRVM基因為靶點的可用于PPRV檢測的特異性引物，另一方面制備了一種可用于富集PPRV病原的特異性免疫磁珠，并最終建立了一種可用于檢測小反芻獸疫病毒抗原的免疫磁珠試劑盒。具體的，為了達到上述目的，本專利技術采用了以下技術手段：本專利技術的一種用于檢測小反芻獸疫病毒抗原的免疫磁珠試劑盒，其包括兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠、以PPRV M基因片段為靶點檢測小反芻獸疫病毒抗原的引物對，RT-PCR反應混合液及RNA聚合酶，所述的引物對的序列分別如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。在本專利技術中，優選的，所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的濃度為10mg/mL。在本專利技術中，優選的，所述的免疫磁珠試劑盒還包括PBS緩沖液，更優選的所述的PBS緩沖液為10mM、pH值為7.4的PBS緩沖液。在本專利技術中，優選的，所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠是通過以下方法制備得到的：1)磁珠的洗滌：取磁珠原液于EP管內，利用磁力架吸附作用，用PBS緩沖液洗滌3次，最后用PBS緩沖液重懸；2)抗體的偶聯：將過量的兔抗PPRV H蛋白IgG抗體加入到步驟1)重懸后的磁珠中，混勻，37℃震蕩15-60min，得到含有兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的混懸液；3)兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的分離：將步驟2)得到的混懸液利用磁力架吸附，除去上清，用PBS緩沖液洗滌3次，最后用PBS緩沖液重懸，即獲得所需的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠。其中，優選的，步驟1)中磁珠原液的體積為200μL，其中所含有磁珠的重量為6mg，使用600μLPBS緩沖液重懸；步驟2)中所述的兔抗PPRV H蛋白IgG抗體的用量為100μg以上。其中，優選的，步驟1)以及步驟3)中所述的PBS緩沖液為10mM、pH值為7.4的PBS緩沖液。其中，優選的，步驟2)中的震蕩時間為20min。其中，優選的，所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的終濃度為10mg/mL。進一步的，本專利技術還公開了所述的免疫磁珠試劑盒在檢測小反芻獸疫病毒抗原中的用途。使用本專利技術所述的免疫磁珠試劑盒用于檢測小反芻獸疫病毒抗原時，按照以下步驟進行：1)病毒的富集：取免疫磁珠于1.5mL的EP管中，加入待檢樣本，37℃震蕩反應20-60min；2)磁珠的洗滌：待病毒富集完成后，將EP管放置于磁力架上，棄去上清，用PBS緩沖液洗滌3次，再加入2-5倍體積的PBS緩沖液將富集病毒的免疫磁珠重懸；3)病毒RNA的提取：用熱裂解法破壞病毒結構，釋放病毒RNA；4)PCR擴增：利用本專利技術所述的試劑盒進行一步法RT-PCR的擴增；5)1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。其中，優選的，步驟1)中每個400μL待檢樣品檢測時使用的免疫磁珠量為20μL，37℃震蕩反應時間為30min；步驟2)中采用的熱裂解法獲得病毒RNA的程序為：95℃裂解10min后迅速冰浴3min；步驟3)中一步法RT-PCR的擴增反應體系為：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL；2×1Step Buffer 25μL；PPRV RNA模板6μL；RNase Free dH2O 15μL；上游引物1μL；下游引物1μL，總體積50μL。擴增程序為：50℃30min；94℃3min；94℃變性30s，57℃復性30s，72℃延伸1min，共進行35個循環；72℃延伸10min后于4℃保存。本專利技術的提出克服了小反芻獸疫病毒抗原檢測過程中PPRV病原易降解，且病原RNA提取過程中使用的待檢毒液體積有限導致所提取的RNA無法達到RT-PCR檢測的最低要求，而出現假陰性結果的問題，為小反芻獸疫病毒抗原的檢測提供了一種有效的技術手段。附圖說明圖1為兔抗PPRV H蛋白血清IgG的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測小反芻獸疫病毒抗原的免疫磁珠試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括兔抗PPRV?H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠、以PPRVM基因片段為靶點檢測小反芻獸疫病毒抗原的引物對，RT?PCR反應混合液及RNA聚合酶，所述引物對的序列分別如SEQ?ID?NO.1以及SEQ?ID?NO.2所示。
【技術特征摘要】
1.一種檢測小反芻獸疫病毒抗原的免疫磁珠試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠、以PPRVM基因片段為靶點檢測小反芻獸疫病毒抗原的引物對，RT-PCR反應混合液及RNA聚合酶，所述引物對的序列分別如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。2.如權利要求1所述的免疫磁珠試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中還包括PBS緩沖液，優選的，所述的PBS緩沖液為10mM、pH值為7.4的PBS緩沖液。3.如權利要求1所述的免疫磁珠試劑盒，其特征在于所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的濃度為10mg/mL。4.如權利要求1所述的免疫磁珠試劑盒，其特征在于所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠是通過以下方法制備得到的：1)磁珠的洗滌：取磁珠原液于EP管內，利用磁力架吸附作用，用PBS緩沖液洗滌3次，最后用PBS緩沖液重懸；2)抗體的偶聯：將過量的兔抗PPRV H蛋白IgG抗體加入到步驟1)重懸后的磁珠中，混勻，37℃震蕩15-60min，得到含有兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的混懸液；3)兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠的分離：將步驟2)得到的混懸液利用磁力架吸附，除去上清，用PBS緩沖液洗滌3次，最后用PBS緩沖液重懸，即獲得所需的兔抗PPRV H蛋白IgG偶聯的免疫磁珠。5.如權利要求4所述的免疫磁珠試劑盒，其特征在于步驟1)中磁珠原液的體積為200μL，其中所含有磁珠的重量為6mg，使用600μL PBS緩沖液重懸；步驟2)中所述的兔抗PPRV H蛋白IgG抗體的用量為100μg以上。6.如權利要求4所述的免疫磁珠試劑盒，其特征在于步驟1)以及步驟3)中...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳錦艷，尚佑軍，張志東，陳妍，王光祥，劉湘濤，尹雙輝，田宏，楊順利，劉永軍，張克山，欒志舫，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所，內蒙古河套農牧業技術研究院，
類型：發明
國別省市：甘肅;62
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