本發明專利技術屬于生物醫藥領域，涉及重組大腸桿菌工程菌。所述的重組大腸桿菌工程菌轉化有重組表達載體，所述的重組表達載體含有表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因。用本發明專利技術的重組大腸桿菌工程菌表達抗TNF抗體Fab片段，可以在明顯提高周質空間表達量的同時明顯促進二硫鍵的正確形成。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術一般的涉及重組大腸桿菌工程菌，特別的涉及表達抗體Fab片段的重組大腸桿菌工程菌。
技術介紹
抗體(antibody，Ab)是一種由抗原(例如細菌、病毒及它們的組分，異源蛋白質)誘導，由機體淋巴細胞(漿細胞)合成與分泌的，用來鑒別與中和抗原的免疫球蛋白類物質。抗體分為多克隆抗體(polyclonal antibody，pAb)和單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，其中前者是由異源抗原或不同的抗原表位刺激機體產生的，后者是由同源抗原乃至相同的抗原表位刺激機體產生的。因此，單克隆抗體較多克隆抗體特異性更強，靈敏度更高，但制備難度與成本也更高。傳統的抗體分子由兩條相同的輕鏈(light chain，LC)與兩條相同的重鏈(heavy chain，HC)形成對稱的Y形結構，分子量150KD左右，輕鏈和重鏈靠近N端的一側形成可變區(variable region，VR，不同抗體的同型可變區氨基酸序列不同)，包括重鏈可變區(heavy chain variable region，HV)與輕鏈可變區(light chain variable region，LV)；靠近C端的一側形成恒定區(constant region，CR，不同抗體的同型恒定區氨基酸序列相同)，包括重鏈恒定區(heavy chain constant region，Hc)與輕鏈恒定區(light chain constant region，Lc)。而重鏈和輕鏈可變區又分別由交錯排布的四個框架區(framework region，FR，不同抗體的氨基酸序列變化較小)與三個互補決定區(complementarity determining region，CDR，不同抗體的氨基酸序列變化較大，尤其是CDR3)組成。兩側的重鏈和輕鏈之間均通過二硫鍵連接起來，兩條重鏈之間亦通過二硫鍵連接。哺乳動物抗體分子的重鏈一共有五種，分別用希臘字母α、δ、ε、γ和μ來命名，相對應的抗體分別稱為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同的重鏈在大小和組成上有所區別，α和γ包含大約450個氨基酸，而μ和ε則有大約550個氨基酸。哺乳動物抗體分子輕鏈只有λ型和κ型兩種類型。輕鏈的長度大約為211～217個氨基酸。抗體分子可以被蛋白水解酶如木瓜蛋白酶水解成2個Fab段和一個Fc段，或者被胃蛋白酶從鉸鏈區(用于連接Fab和Fc段的富含脯氨酸的結構區域，其包含了重鏈間的二硫鍵)斷開，水解成一個F(ab)2段和一個Fc段。Fab片段是由重鏈Fd段和完整輕鏈通過鏈間二硫鍵形成的異二聚體，質量約占抗體分子的1/3。由于缺少Fc段，Fab段既不會和抗原發生沉淀，也不會在活體研究中被免疫細胞捕獲。傳統的單克隆抗體是通過雜交瘤細胞技術制備的，屬于鼠源性抗體。為了降低乃至消除鼠源性抗體用于人體引起的人抗鼠抗體反應(HAMA)，自上世紀80年代中后期開始，研究者探索以基因工程方法改造鼠源性單克隆抗體，從而制備出了包括嵌合抗體(將鼠抗體的恒定區替換為人抗體的恒定區)與人源化抗體(在嵌合抗體的基礎上進一步將可變區的框架區替換為人抗體的框架區)的基因工程抗體，并在此基礎上進一步制備獲得了重組的全人序列的全人抗體。同時，鑒于完整的抗體分子因表達量及產量低、純化及質控難、成本高等原因較難以制備，分子量過大難以穿過細胞外間隙進入細胞，容易引起免疫反應等原因，所以又采用基因工程方法使抗體分子小型化，制備出了各種小分子抗體，包括單鏈抗體(scFv，由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過15～20個氨基酸的短肽(linker)連接而成)、Fab抗體等。抗體藥物是以細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術制備的藥物，具有特異性高、性質均一、可針對特定靶點定向制備等優點。截至2014年底，全球共有針對37種靶標的59個抗體藥物產品被批準上市，針對包括各種腫瘤、自身免疫性疾病在內的36種適應癥，形成了847億美元的年市場銷售額，且當年全球銷售額排名前10的藥物中有6個是抗體藥物。而在這37種靶標中，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是最熱門的靶標，僅此一個靶標的抗體藥物2014年全球銷售額就達到了345億美元，高居所有靶標抗體藥物銷售額之首，也使自身免疫性疾病適應癥力壓腫瘤適應癥成為抗體藥物銷售額最高的適應癥。以TNF為靶標的抗體藥物主要針對以類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、節段性腸炎(Crohn′s disease，CD)、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、銀屑病關節炎(psoriatic arthritis，PA)為代表的自身免疫性疾病的治療。目前上市的抗TNF抗體藥物主要有5種，分別為infliximab(英夫利昔單抗，商品名Remicade，嵌合抗體)、adalimumab(阿達木單抗，商品名Humira，全人抗體)、golimumab(戈利木單抗，商品名Simponi，全人抗體)、certolizumab(賽妥珠單抗，商品名Cimzia，人源化PEG修飾的Fab抗體)以及etanercept(依那西普，商品名Enbrel，TNF受體與抗體Fc段的融合蛋白)，其中adalimumab、infliximab、etanercept在2014年全球銷售排名前10的藥物中分別排名第1、3、4位，而certolizumab在2014年的全球銷售額也達到了10億美元以上的規模。鑒于如前所述的小分子抗體相較于完整分子抗體的優勢，類比certolizumab先制備抗TNF抗體Fab片段的小分子抗體，再用PEG修飾以克服小分子抗體半衰期短、穩定性差的缺點就有了相當的可行性。雖然Fab抗體可以利用諸多表達系統，如細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲和植物表達系統表達，但應用最為廣泛的還是大腸桿菌(E.coli)表達系統。但大腸桿菌表達Fab抗體最大的問題是容易形成包涵體表達造成表達產物不溶解和無活性，由此必須進一步進行的變復性過程更容易造成Fab抗體的錯誤折疊和二硫鍵(Fab抗體有4個鏈內和1個鏈間二硫鍵)的錯誤配對。解決這一問題的方法是盡量讓Fab抗體表達在大腸桿菌周質空間(periplasm space)中。不過即使Fab抗體在大腸桿菌周質空間中表達，如果過量表達仍然存在錯誤折疊和二硫鍵錯誤配對的問題，由此對表達Fab抗體的量及其以二硫鍵形成為代表的正確結構的形成、生物學活性都有較大影響。現有技術中公開了一些共表達分子伴侶(molecular chaperones)類物質以解決大腸桿菌周質空間中表達抗體片段存在上述問題的方法。例如發表在Microbial Cell Factories 2010年第9卷第1期上的文獻Co-expression of Skp and FkpA chaperones improves cell viability and alters the global expression of stress response genes during scFvD1.3production公開了在E.coli BL21中將scFvD1.3抗體片段與Skp或FkpA共本文檔來自技高網...
【技術保護點】
重組大腸桿菌工程菌，其特征是轉化有重組表達載體，所述的重組表達載體含有表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因。
【技術特征摘要】
1.重組大腸桿菌工程菌，其特征是轉化有重組表達載體，所述的重組表達載體含有表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因。2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌工程菌，其特征是所述的大腸桿菌工程菌選自BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Arctic Express、Origami B(DE3)中的一種。3.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌工程菌，其特征是所述的大腸桿菌工程菌是BL21(DE3)。4.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌工程菌，其特征是所述的表達載體是質粒載體，選自pET23b、pET24a、pET28a、pET30a、pET32a、pCDFDuet-1、pET15b、pET21a、pETDuet-1、pACYC 184、pTXB 1、pTYB21。5.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌工程菌，其特征是所述的表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因位于同一或不同的重組表達載體內，且當位于不同的重組表達載體內時不同的重組表達載體之間是兼容的。6.根據權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：童梅，劉美君，莫婷，張宇萌，徐晨，周敏毅，
申請(專利權)人：北京三元基因藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。