YycG-PAS單克隆抗體及其用途制造技術

本發明專利技術屬生物技術領域，涉及一種能夠特異性結合YycG組氨酸激酶的胞外區PAS區域的單克隆抗體，及其在制備抑制葡萄球菌生物膜形成的制劑的用途。本發明專利技術的單克隆抗體以表皮葡萄球菌YycG組氨酸激酶的PAS區域為抗原，免疫小鼠制成；所述的單克隆抗體能識別位于YycG蛋白，并抑制表皮葡萄球菌生物膜形成。本發明專利技術的單克隆抗體可用于制備治療由葡萄球菌引起的生物膜相關疾病的藥物，所述單克隆抗體針對的YycG-PAS多肽可用于制備抗葡萄球菌生物膜形成的疫苗。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生物
，涉及一種抑制葡萄球菌生物膜形成的單克隆抗體，具體涉及一種能夠特異性結合YycG組氨酸激酶的胞外區PAS區域的單克隆抗體，及其在制備抑制葡萄球菌生物膜形成的制劑的用途。
技術介紹
葡萄球菌(包括表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌)是導致人體生物膜感染性疾病的重要病原體，其致病力主要在于可在植入性醫療材料表面形成生物膜，從而使葡萄球菌感染在這些植入病人體內慢性化和持續化。由于形成生物膜的葡萄球菌可以抵抗多種抗生素和宿主免疫系統的清除作用。目前臨床尚無有效治療細菌生物膜病的藥物，一旦發生葡萄球菌生物膜感染，徹底治療的唯一方法是手術摘除或更換植入性醫療材料。因此，具有抑制葡萄球菌生物膜形成作用的制劑在發揮預防和治療生物膜感染性疾病方面具有廣泛的應用前景。研究表明，在葡萄球菌形成生物膜的過程包括，細菌粘附于大分子醫療材料表面，進而釋放胞外多聚物細菌間的相互粘附和聚集，促使細菌形成生物膜，涉及多基因編碼的因子參與。阻斷YycG/F雙組份信號轉導系統的YycG(組氨酸激酶)胞外信號感受區(PAS)，是否可以影響細菌生物膜的形成，引起了本領域研究者的關注，但目前尚無文獻報道YycG/F雙組份信號轉導系統的抗體可抑制葡萄球菌生物膜形成。本申請的專利技術人擬提供一種能夠特異性結合YycG組氨酸激酶的單克隆抗體，及其在制備抑制葡萄球菌生物膜形成的制劑的用途。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種抑制葡萄球菌生物膜形成的單克隆抗體；具體涉及一種能夠特異性結合YycG組氨酸激酶的胞外PAS區域并具有抑制葡萄球菌生物膜形成作用的單克隆抗體。本專利技術通過生物信息學分析顯示YycG的胞外PAS區在葡萄球菌中保守，
具有高度同源性，PAS區域為親水蛋白，含有B細胞表位，可與抗體結合；以表皮葡萄球菌YycFG雙組份信號轉導系統中YycG組氨酸激酶的PAS區(位于表皮葡萄球菌ATCC 35984株YycG蛋白氨基酸序列中第34位至184位)為抗原，免疫小鼠制備YycG-PAS單克隆抗體；所述的單克隆抗體能識別位于YycG為組氨酸激酶的PAS區并具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的作用。本專利技術中，YycF/G雙組份信號轉導系統，由YycF組氨酸激酶和YycG反應蛋白組成，調控葡萄球菌細胞壁合成和細菌生物膜的形成，其核苷酸序列和蛋白序列在葡萄球菌中高度同源。YycG為組氨酸激酶是跨膜蛋白，其胞外的PAS功能域可感受外界環境信號，傳遞至胞內的組氨酸激酶，使其磷酸化，進而將反應調節蛋白磷酸化，調控下游基因的表達。具體而言，本專利技術的YycG-PAS單克隆抗體，其特征在于含有識別位于YycG為組氨酸激酶的PAS區的IgG。本專利技術的YycG-PAS單克隆抗體通過下述方法制備，以表皮葡萄球菌YycG為組氨酸激酶的PAS區(位于表皮葡萄球菌ATCC 35984株YycG蛋白氨基酸序列中第34位至184位)為抗原，免疫Bal b/c小鼠制備YycG-PAS單克隆抗體；經測定，所述的單克隆抗體為小鼠IgG。本專利技術實施例中，以表皮葡萄球菌ATCC 35984株的基因組DNA為模板，擴增yycG胞外信號感應區域pas片段(nt 100位至552位bp)，與原核表達載體pET28a質粒連接，并大腸埃希菌BL21表達所述的DNA片段編碼的YycG-PAS蛋白；采用Ni2+親和層析、TEV蛋白酶水解蛋白標簽、分子篩等方法對重組YycG-PAS蛋白進行純化，獲得YycG-PAS蛋白，免疫小鼠，制得YycG-PAS單克隆抗體。本專利技術的進一步目的是提供所述的單克隆抗體的用途，尤其是在制備抑制葡萄球菌生物膜形成的制劑的用途。本專利技術所述的YycG-PAS單克隆抗體經試驗證實，其能識別位于YycG為組氨酸激酶的PAS區，具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的作用；進一步本專利技術的YycG-PAS單克隆抗體可用于制備抑制葡萄球菌生物膜形成的制劑。本專利技術采用酶聯免疫試驗(ELISA)、免疫斑點法和印跡試驗(Western blot)檢測YycG-PAS單克隆抗體與表皮葡萄球菌YycG蛋白結合的親和力與特異性；采用
微量細菌生物膜檢測試驗、激光共聚焦顯微鏡檢測試驗，檢測YycG-PAS單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響。如表1所示，ELISA法檢測結果表明，所述的單克隆抗體在被稀釋到152ng/mL時，仍然能特異性結合重組YycG-PAS蛋白。如圖1A和圖1B所示，免疫斑點法(Dot blot)和印跡試驗(Western blot)檢測結果表明，YycG-PAS單克隆抗體可與表皮葡萄球菌菌體的YycG蛋白結合。如圖2所示，微量細菌生物膜檢測表明，所述YycG-PAS單克隆抗體對表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株株生物膜的形成有明顯的抑制作用，可抑制生物膜形，抑制率達～46.5％(如圖2A所述)。如圖3所示，激光共聚焦顯微鏡檢測表明，表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株株在所述的YycG-PAS單克隆抗體存在的條件下，形成的生物膜明顯變薄，同時生物膜中的死亡細菌數量增多。如表2所示，YycG-PAS MAb與萬古霉素聯合使用，可增強YycG-PAS單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制率(增至93％)。本專利技術中，所述的葡萄球菌是表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。本專利技術的YycG-PAS單克隆抗體可進一步進行人源化改造，改造后的抗體可作為抗葡萄球菌的抗體藥物使用；本專利技術還提供了YycG-PAS單克隆抗體與萬古霉素的藥物組合物，所述的YycG-PAS單克隆抗體與萬古霉素聯合使用可增強YycG-PAS單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制率。本專利技術的抑制細菌生物膜形成的單克隆抗體的優點在于：可特異性結合調控表皮葡萄球菌生物膜形成過程中的調控蛋白YycG組氨酸激酶的胞外PAS區，并發揮抑制生物膜形成的作用；提示PAS多肽有可能誘導動物或人體產生與本專利技術單克隆抗體功能相似的具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的抗體，即該多肽可用于制備抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗。本專利技術的抑制細菌生物膜形成的單克隆抗體可用于制備抗葡萄球菌生物膜形成的藥物，和用于制備治療葡萄球菌引起的生物膜病的藥物；所述的抑制細菌生物膜形成的單克隆抗體所針對的PAS的區域可用于制備抗葡萄球菌生物膜形成疫苗。附圖說明圖1是不同生長階段表皮葡萄球菌中YycG蛋白的表達，其中，圖1A：免疫斑點法檢測YycG-PAS單克隆抗體與重組YycG-PAS蛋白和菌體蛋白的結合；圖1B：免疫印跡法檢測YycG-PAS單克隆抗體與與表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株的菌體YycG蛋白的結合。圖2是YycG-PAS單克隆抗體對表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株株生物膜形成的影響，其中，以不做任何處理的細菌生物膜以及80μg/mL的正常小鼠IgG處理為對照，80μg/mL的YycG-PAS單克隆抗體加入培養基中與表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株株共同培養6或24小時，利用結晶紫染色觀察。圖3是激光共聚焦顯微鏡觀察單克隆抗體對表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株株生物膜形成的影響，其中，以不經任何處理的細菌生物膜(ATCC 35984菌株)以及80μg/mL的正常小鼠IgG處理(Mock)為對照，將80μ本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種YycG?PAS單克隆抗體，其特征在于，含有識別位于YycG為組氨酸激酶的PAS區的IgG。

【技術特征摘要】
1.一種YycG-PAS單克隆抗體，其特征在于，含有識別位于YycG為組氨酸激酶的PAS區的IgG。2.按權利要求1所述的YycG-PAS單克隆抗體，其特征在于，通過下述方法制備，以表皮葡萄球菌YycG為組氨酸激酶的PAS區(位于表皮葡萄球菌ATCC35984株YycG蛋白氨基酸序列中第34位至184位)為抗原，免疫小鼠制備YycG-PAS單克隆抗體。3.權利要求1的YycG-PAS單克隆抗體在制備抑制葡萄球...

【專利技術屬性】
技術研發人員：瞿滌，吳旸，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：上海;31