一種提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法技術

本發明專利技術為一種提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法，包括種子的消毒與播種、無菌苗的獲得、外植體的選擇和愈傷組織的誘導、體細胞胚的誘導、體細胞胚的繼代與增值、體細胞胚的成熟步驟；外植體為子葉或下胚軸；從愈傷組織誘導到體細胞胚的成熟過程均在黑暗條件下進行。本發明專利技術縮短了辣椒體胚發生的時間，提高了體胚發生的量，從而改善了體胚的發生效率。為實現辣椒轉基因研究、生物技術育種等奠定了基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于辣椒體細胞胚的發生領域，具體涉及一種提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法。
技術介紹
辣椒是茄科辣椒屬，一年或有限多年生草本植物，原產于墨西哥，是一種重要的蔬菜作物，在世界范圍內普遍栽培。《綱目拾遺》記載：辣茄性熱而散，亦能去水濕；《百草鏡》亦指出辣椒可洗凍瘡，浴冷疥，瀉大腸經寒癖，具有一定的藥用價值。辣椒作為一種具有重要經濟價值的作物，對水份要求嚴格，即不耐旱也不耐澇，部分性狀有待改良。目前，辣椒主要通過有性生殖等方式進行繁殖，但傳統的育種方法不能很好的滿足許多遺傳改良的需求。因此建立穩定高效的辣椒體細胞胚發生體系為利用細胞工程等現代技術進行辣椒遺傳育種具有重要意義，如培養脫毒作物、保持母本遺傳特征、為辣椒遺傳轉化或誘變育種選育新品種提供理想的受體體系等。目前，辣椒體細胞胚的發生還存在許多問題，主要為周期長、發生頻率低、易玻璃化等，現有的胚誘導周期約為200d，且發生頻率低于1％。
技術實現思路
為了克服現有辣椒體細胞胚發生的技術不足，本專利技術的目的在于提供一種周期短、不會出現玻璃化現象，特別是能在很大程度上提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供了以下技術方案：一種提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法，該方法包括消毒與播種、無菌苗的獲得、外植體的選擇和愈傷組織的誘導、體細胞胚的誘導、體細胞胚的繼代與增值、體細胞胚的成熟步驟；外植體為子葉或下胚軸；從愈傷組織誘導到體細胞胚的成熟過程均在黑暗條件下進行；其中，無菌苗的獲得過程中使用的MS1培養基為：1/2MS+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L；外植體的選擇和愈傷組織的誘導過程中使用的MS2培養基為：MS+2，4-D 2mg/L+Biotin 1mg/L+半胱氨酸5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L；體細胞胚的誘導過程中使用的MS3培養基為：MS+2，4-D 1mg/L+半胱氨酸5mg/L+蔗糖35g/L；體細胞胚的繼代與增值過程中使用的MS4培養基為：MS+2，4-D 1mg/L+6-BA 1.5mg/L+Biotin 1mg/L+L-脯氨酸100mg/L+麥芽提取物100mg/L+蔗糖40g/L；體細胞胚的成熟過程中使用的MS5培養基為：MS+ABA 0.5mg/L+蔗糖30g/L。其中，MS為基礎培養基，2，4-D為2，4-二氯苯氧乙酸、Biotin為生物素。本專利技術進一步包括以下優選的技術方案：優選的方案中，所述無菌苗的獲得過程中，將消毒種子置于超凈工作臺內，接種到pH值為5.6～5.8的MS1培養基中，在25±2℃，8/16h光照條件下培養11～13d得到無菌苗。優選的方案中，所述外植體的選擇和愈傷組織的誘導過程中，在無菌操作條件下，將獲得的無菌苗的子葉和下胚軸置于pH值為5.6～5.8的MS2培養基中，在培養溫度為25±2℃，黑暗條件下培養11～13d，得到愈傷組織。優選的方案中，所述體細胞胚的誘導過程中，在無菌操作條件下，從得到的愈傷組織中挑選胚性愈傷組織，將愈傷組織與子葉和下胚軸切分，并轉至pH值為5.2～5.4的MS3培養基中誘導體細胞胚，在培養溫度為25±2℃，黑暗條件下進行懸浮培養，得到懸浮細胞。優選的方案中，所述體細胞胚的繼代與增值過程中，在無菌操作條件下，將懸浮細胞每15d進行一次繼代，懸浮細胞轉移至pH值為5.6～5.8的MS4培養基中，在培養溫度為25±2℃，黑暗條件下培養，直到獲得大量體細胞胚。優選的方案中，所述體細胞胚的成熟過程中，在無菌操作條件下，將獲得的體細胞胚轉移至pH值為5.6～5.8的MS5培養基中，在培養溫度為25±2℃，黑暗條件下培養成熟。優選的方案中，所述培養基MS1培養基～MS5培養基均使用0.5～1.0mol/L的NaOH水溶液調節pH值。優選的方案中，所述培養基MS1培養基～MS5培養基中含VB1，所述VB1的濃度為10mg/L。優選的方案中，所述半胱氨酸使用前，通過鹽酸助溶。優選的方案中，MS4培養基中不含KNO3，MS4培養基和MS5培養基中含NH4NO3，所述NH4NO3的濃度為10μM/L。優選的方案中，所述體細胞胚的誘導過程中挑選淡黃色、表面有球狀突起的胚性愈傷組織。優選的方案中，生物素用50℃溫水溶解，加入培養基前隔水加熱使其溶解完全。優選的方案中，所有懸浮培養均使用100mL錐形瓶，加入50mL培養液，搖床轉速設為150rpm/min。進一步優選所述外植體為子葉。本專利技術的優點如下：本專利技術通過對辣椒體細胞胚發生步驟、培養基以及培養方式進行綜合改進，得到了一種周期短、不會出現玻璃化現象，特別是能在很大程度上提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法。本專利技術從播種無菌苗到獲得游離的體細胞胚僅需約60d的時間，且體細胞胚的誘導率(即發生頻率)最高可達0.56個/mg。在具體的實驗過程中，本專利技術以子葉或下胚軸為外植體，在愈傷組織和體細胞胚的誘導階段，分別加入半胱氨酸和L-脯氨酸，從愈傷組織誘導到體細胞胚的成熟過程中均在黑暗條件下進行，這些條件的綜合控制與協同作用，不僅使實驗操作較成熟合子胚簡便，省略從種皮中剝離出合子胚的復雜步驟，且使胚性愈傷組織和體細胞胚的誘導率分別提高了8％和21％，獲得了意料之外的技術效果。而通過進一步通過在體細胞胚的繼代與增值過程中利用現有的體細胞胚進行二次誘導，控制MS4培養基的pH值為5.6～5.8，整體培養過程中無需加入KNO3，體細胞胚的成熟在NH4NO3的濃度降低為10μM/L的培養基中進行，不僅有利于維持培養基的偏酸性環境，進一步縮短整個培養周期，有效提高體細胞胚的增值，提高了體細胞胚的誘導率和成熟率。本專利技術通過對各個步驟的優化還進一步減少了玻璃化現象。但本專利技術并不僅僅在于上述參數的控制和優化，專利技術人在具體的辣椒體細胞胚發生過程中，通過培養基、培養方式，以及其他條件和參數的配合，不斷優化，最終才獲得了本專利技術的協同增效的有益效果。本專利技術為實現辣椒轉基因研究、生物技術育種等奠定了基礎。附圖說明圖1a為辣椒非胚性愈傷組織在解剖鏡下拍攝照片；圖1b為辣椒胚性愈傷組織在解剖鏡下拍攝照片；圖1c為辣椒游離體細胞胚在解剖鏡下拍攝照片；圖2a為辣椒體細胞早期原胚固定、切片及番紅-固綠染色后在顯微鏡下拍攝照片；圖2b為辣椒原胚胚固定、切片及番紅-固綠染色后在顯微鏡下拍攝照片；圖2c為辣椒游離胚固定、切片及番紅-固綠染色后在顯微鏡下拍攝照片；具體實施方式實施例1(1)消毒與播種：取辣椒(樟樹港)干燥種子，用0.1v/v％升汞消毒10min，無菌水沖洗5次，備用；(2)無菌苗的獲得：將步驟(1)得到的消毒種子置于超凈工作臺內，接種到pH值為5.8的MS1培養基中，在25℃，8/16h光照條件下培養12d得到無菌苗；(3)外植體的選擇和愈傷組織的誘導：無菌操作條件下，將步驟(2)中無菌苗的子葉和下胚軸置于pH值為5.8的MS2培養基中，在培養溫度為25℃，黑暗條件下培養12d，得到愈傷組織；(4)體細胞胚的誘導：無菌操作條件下，從步驟(3)中得到的愈傷組織中挑選胚性愈傷組織，將愈傷組織與子葉和下胚軸切分，并轉至pH值為5.4的MS3培養基誘導體細胞胚，在培養溫度為25℃，黑暗條件下進行懸浮培養；(5)體細胞胚的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法，其特征在于，包括種子的消毒與播種、無菌苗的獲得、外植體的選擇和愈傷組織的誘導、體細胞胚的誘導、體細胞胚的繼代與增值、體細胞胚的成熟步驟；外植體為子葉或下胚軸；從愈傷組織誘導到體細胞胚的成熟過程均在黑暗條件下進行；其中，無菌苗的獲得過程中使用的MS1培養基為：1/2MS+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L；外植體的選擇和愈傷組織的誘導過程中使用的MS2培養基為：MS+2，4?D2mg/L+Biotin1mg/L+半胱氨酸5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L；體細胞胚的誘導過程中使用的MS3培養基為：MS+2，4?D?1mg/L+半胱氨酸5mg/L+蔗糖35g/L；體細胞胚的繼代與增值過程中使用的MS4培養基為：MS+2，4?D1mg/L+6?BA1.5mg/L+Biotin1mg/L+L?脯氨酸100mg/L+麥芽提取物100mg/L+蔗糖40g/L；體細胞胚的成熟過程中使用的MS5培養基為：MS+ABA0.5mg/L+蔗糖45g/L。

【技術特征摘要】
1.一種提高辣椒體細胞胚發生頻率的方法，其特征在于，包括種子的消毒與播種、無菌苗的獲得、外植體的選擇和愈傷組織的誘導、體細胞胚的誘導、體細胞胚的繼代與增值、體細胞胚的成熟步驟；外植體為子葉或下胚軸；從愈傷組織誘導到體細胞胚的成熟過程均在黑暗條件下進行；其中，無菌苗的獲得過程中使用的MS1培養基為：1/2MS+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L；外植體的選擇和愈傷組織的誘導過程中使用的MS2培養基為：MS+2，4-D2mg/L+Biotin1mg/L+半胱氨酸5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L；體細胞胚的誘導過程中使用的MS3培養基為：MS+2，4-D 1mg/L+半胱氨酸5mg/L+蔗糖35g/L；體細胞胚的繼代與增值過程中使用的MS4培養基為：MS+2，4-D1mg/L+6-BA1.5mg/L+Biotin1mg/L+L-脯氨酸100mg/L+麥芽提取物100mg/L+蔗糖40g/L；體細胞胚的成熟過程中使用的MS5培養基為：MS+ABA0.5mg/L+蔗糖45g/L。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述無菌苗的獲得過程中，將消毒種子置于超凈工作臺內，接種到pH值為5.6～5.8的MS1培養基中，在25±2℃，8/16h光照條件下培養11～13d得到無菌苗。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述外植體的選擇和愈傷組織的誘導過程中，在無菌操作條件下，將獲得的無菌苗的子葉和下胚軸置于pH值為5.6～5.8的MS2培養基中，在培...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄒學校，劉峰，張亞利，戴雄澤，馬艷青，李雪峰，鄭井元，
申請(專利權)人：湖南省蔬菜研究所，
類型：發明
國別省市：湖南;43