本發明專利技術公開了一種提高玉米單倍體雄穗育性恢復能力的方法及其專用引物。本發明專利技術通過對單倍體雄穗育性恢復相關QTL的定位，開發相關的連鎖標記，利用該標記進行分子標記輔助育種。本發明專利技術所提供的鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的方法能直接在苗期鑒定出含有位于6號染色體主效QTL位點qhmf4的單株，選擇出含有該QTL位點的單株，有助于提高玉米單倍體雄穗育性恢復，促進玉米DH育種的利用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種提高玉米單倍體雄穗育性恢復能力的方法及其專用引物，屬于分子遺傳學育種領域。
技術介紹
玉米是我國第一大糧食作物(張春雷，2012)，不但可以作為食用、飼用和工業等的重要來源，而且具有適應性廣和高產的特征。隨著氣候環境的變化和人口的不斷增長，為了滿足對糧食的需求，加快育種流程是必經之路。與連續自交5-7代得到純合自交系的常規育種方法相比，單倍體育種只需要誘導和加倍兩代便可產生純系，能顯著縮短育種年限，加快育種流程，提高育種效率。玉米單倍體育種主要包括單倍體誘導、單倍體鑒別和單倍體加倍三個步驟。隨著新型誘導系的選育，鑒別效率的不斷提高，單倍體加倍成為玉米單倍體育種的主要限制因素。單倍體的染色體加倍方法主要有兩種：化學加倍和自然加倍。化學加倍是指利用一些化學試劑誘導單倍體染色體加倍。最常用的化學加倍方法是秋水仙素芽苗浸泡法。盡管利用秋水仙素進行人工加倍能夠大規模的產生DH系(Gayen et al.,1994；Barnabás et al.,1999)，但是這種化學試劑昂貴，毒性大，使用過程中需要發苗、移苗，操作繁瑣，因此其利用具有一定局限性。自然加倍是指在自然環境條件下單倍體染色體發生自發的加倍(Jensen,1974)。目前，許多物種中都發現了一定比例的單倍體自然加倍。例如，油菜自然加倍率為10-40％(Henry,1998)，玉米的自然加倍效率為0-21.4％(Barnabas et al.,1999)。玉米單倍體自然加倍受環境和基因型的影響。Kleiber(2012)對溫帶玉米種質和熱帶玉米種質的單倍體自然加倍率進行了考察，結果發現溫帶骨干種質的單倍體自然加倍效率大于溫帶地方品種的單倍體自然加倍效率，早熟種質來源的單倍體自然加倍效率要高于晚熟品種，溫室條件下單倍體自然加倍效率大于大田條件下單倍體自然加倍效率。玉米單倍體自然加倍又可以分為單倍體雄穗育性恢復和雌穗育性恢復。用來源于正常二倍體植株的花粉給單倍體雌穗授粉，單倍體雌穗育性恢復率能達到90％以上。而單倍體雄穗育性恢復率只有5-10％，遠遠低于單倍體雌穗育性恢復，因此，單倍體雄穗育性恢復情況是影響單倍體自然加倍的主要因素。分子標記輔助技術可以利用分子標記對目標性狀直接進行選擇，提高育種效率，尤其是對復雜性狀的選育，如抗病性和單倍體誘導率。分子標記輔助選擇的基礎是對性狀的QTL定位及其過程中連鎖標記的開發。例如，董昕等對單倍體誘導率相關QTL進行定位，并對第一條染色體位點qhir1進行精細定位，開發相關的分子標記進行誘導系的選育。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的引物對。本專利技術提供的用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的引物對由序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成。本專利技術的第二個目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的PCR試劑。本專利技術提供的用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的PCR試劑包括上述引物對。上述PCR試劑中，所述引物對中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為5ng/ul。本專利技術的第三個目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的試劑盒。本專利技術提供的用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的試劑盒包括上述引物對或上述PCR試劑。本專利技術的第四個目的是提供上述引物對或上述PCR試劑或上述試劑盒的新用途。本專利技術提供了上述引物對或上述PCR試劑或上述試劑盒在如下(1)-(5)中任一種中的應用：(1)鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀；(2)制備鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的產品；(3)選育單倍體雄穗育性恢復能力高的玉米單倍體；(4)制備選育單倍體雄穗育性恢復能力高的玉米單倍體的產品；(5)玉米育種。本專利技術的第五個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的方法。本專利技術提供的鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的方法包括如下步驟：用上述引物對對待測玉米基因組進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測所述PCR擴增產物，根據所述PCR擴增產物確定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀：PCR擴增產物中僅含有大小為265bp片段的待測玉米單株的單倍體雄穗育性恢復能力高于或候選高于PCR擴增產物中僅含有大小為226bp片段的待測玉米單株的單倍體雄穗育性恢復能力。上述方法中，所述待測玉米單株為由一個單倍體雄穗育性恢復能力高和一個單倍體雄穗育性恢復能力低的親本雜交，得到雜交子代，將所述雜交子代與所述單倍體雄穗育性恢復能力低的親本回交，得到回交后代，再以單倍體誘導系為父本，對所述回交后代進行誘導獲得的單倍體。上述方法中，所述單倍體雄穗育性恢復能力體現在花藥外露率和/或花藥得分。上述方法中，所述花藥外露率是指單倍體的花藥外露的比例，根據單倍體花藥外露的比例從低到高，將花藥外露率劃分為如下0‐5六個等級：0級為不散；1級為5％以下的花藥外露；2級為6‐20％的花藥外露；3級為21‐50％的花藥外露；4級為51‐75％的花藥外露；5級為75％以上的花藥外露。所述花藥得分取決于花藥外露率的級別，花藥外露率的級別為0級對應的花藥得分為0分，花藥外露率的級別為1級對應的花藥得分為0.2分，花藥外露率的級別為2級對應的花藥得分為0.4分，花藥外露率的級別為3級對應的花藥得分為0.6分，花藥外露率的級別為4級對應的花藥得分為0.8分，花藥外露率的級別為5級對應的花藥得分為1分。上述方法中，所述回交的次數為2次。上述方法中，所述單倍體雄穗育性恢復能力高的親本為豫87-1和4F1；所述單倍體雄穗育性恢復能力低的親本為鄭58；所述單倍體誘導系為誘導系CAU5。本專利技術的最后一個目的是提供一種選育單倍體雄穗育性恢復能力高的玉米單倍體的方法。本專利技術提供的選育單倍體雄穗育性恢復能力高的玉米單倍體包括如下步驟：培育上述PCR擴增產物中僅含有大小為265bp片段的玉米單倍體。本專利技術提供了一種鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的方法及其專用引物，本專利技術通過對單倍體雄穗育性恢復相關QTL的定位，開發相關的連鎖標記，利用該標記進行分子標記輔助育種。本專利技術所提供的鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的方法能直接在苗期鑒定出含有位于6號染色體主效QTL位點qhmf4的單株，選擇出含有該QTL位點的單株，有助于提高玉米單倍體雄穗育性恢復率，促進玉米DH育種的利用。附圖說明圖1為豫87-1、4F1和鄭58的瓊脂糖電泳圖。其中，1、2為豫87-1單株；3、4為4F1單株；5、6為鄭58單株。圖2為F1單倍體群體的瓊脂糖電泳圖。其中，1-10為(鄭58/豫87-1)單倍體單株；11為鄭58單倍體單株；12為豫87-1單倍體單株。圖3為BC2群體單株的瓊脂糖電泳圖。其中，1-10為鄭58回交鄭58/豫87-1兩代的BC2群體，11為鄭58單株，12為豫87-1單株。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。下述實施例中的單倍本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的引物對，其由序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成。
【技術特征摘要】
1.用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的引物對，其由序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成。2.用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的PCR試劑，包括權利要求1所述的引物對。3.根據權利要求2所述的PCR試劑，其特征在于：所述引物對中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為5ng/ul。4.用于鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的試劑盒，包括權利要求1所述的引物對或權利要求2或3所述的PCR試劑。5.權利要求1所述的引物對或權利要求2或3所述的PCR試劑或權利要求4所述的試劑盒在如下(1)-(5)中任一種中的應用：(1)鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀；(2)制備鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的產品；(3)選育單倍體雄穗育性恢復能力高的玉米單倍體；(4)制備選育單倍體雄穗育性恢復能力高的玉米單倍體的產品；(5)玉米育種。6.一種鑒定或輔助鑒定待測玉米單倍體雄穗育性恢復性狀的方法，包括如下步驟：用權利要求1所述的引物對對待測玉米基因組進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測所述PCR擴...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳紹江，任姣姣，吳鵬昊，田小龍，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
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