本發明專利技術公開了利用纖維素內切酶和β?葡糖苷酶構建食品安全級載體及篩選培養基，屬于基因工程領域。一種食品安全級載體，以纖維素內切酶、β?葡糖苷酶為篩選標記，含有纖維素內切酶編碼基因、β?葡糖苷酶編碼基因，能表達纖維素內切酶和β?葡糖苷酶。該載體的篩選培養基沒有微生物可直接利用的碳源，包含羥甲基纖維素鈉和梔子藍。將纖維素內切酶編碼基因、β?葡糖苷酶編碼基因克隆到載體上得到食品安全級載體。本發明專利技術利用纖維素內切酶以及β?葡糖苷酶作為篩選標記酶，同時利用特殊的篩選培養基，能夠快速準確的篩選出轉化子；由于篩選標記不為抗生素，因而為食品安全級的載體。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程領域，涉及利用纖維素內切酶和β-葡糖苷酶構建食品安全級載體及篩選培養基。
技術介紹
現在大多數的載體都是利用抗生素的抗性作為載體的篩選標記，抗生素對人類食品安全的危害是很多的，因此利用抗生素作為篩選標記的載體其應用就有很多局限性。作為篩選標記必須具有以下特點：能夠輕易區分轉化子和非轉化子；能夠讓目的基因片段或目的單元整合在基因組中，或穩定在宿主菌中存在。在構建基因工程菌中，對于整合型質粒有更多的偏愛，整合型質粒不會輕易環出，相對而言具有更好的穩定性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于在于提供一種食品安全級載體及其構建方法與篩選培養基。本專利技術的目的通過下述技術方案實現：一種食品安全級載體，以纖維素內切酶、β-葡糖苷酶為篩選標記，含有纖維素內切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因，能表達纖維素內切酶和β-葡糖苷酶。優選的，所述的纖維素內切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因來源于黑曲霉。所述的纖維素內切酶編碼基因的序列優選如SEQ ID NO.1所示。所述的β-葡糖苷酶編碼基因的序列優選如SEQ ID NO.2所示。所述的食品安全級載體的構建方法，包括如下步驟：將纖維素內切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因克隆到載體上，使載體能夠表達纖維素內切酶和β-葡糖苷酶。優選的，所述的食品安全級載體的構建方法包括如下步驟：將SEQ ID NO.3所示序列、SEQ ID NO.4所示序列通過限制性內切酶及DNA連接酶構建到pPIC9K載體上；其中限制性內切酶為SnaBI、EcoR I和AvrII、NotI，SnaBI、EcoR I對應酶切SEQ ID NO.3所示序列，AvrII、NotI對應酶切SEQ ID NO.4所示序列。所述的食品安全級載體的篩選培養基，包含羥甲基纖維素鈉和梔子藍。該培養基沒有微生物可直接利用的碳源，只有載體上的纖維素內切酶和β-葡糖苷酶同時表達后，才能把羥甲基纖維素鈉轉化成葡萄糖，使微生物生長增值。同時β-葡糖苷酶把梔子藍轉化成梔子紅，從而使菌落周圍呈現淡淡紅色。基于此，纖維素內切酶編碼基因和β-葡糖苷酶編碼基因組合可用于構建食品安全級載體。優選的，所述的篩選培養基的配方為：羥甲基纖維素鈉10g/L，梔子藍1.5g/L，NH4NO3 1.0g/L，NaCl 2g/L，YGM003A酵母細胞全合成培養基YGM003A-1 1.5g/L，瓊脂20g/L。本專利技術利用纖維素內切酶和β-葡糖苷酶作為篩選標記酶，同時利用特殊設計的篩選培養基平板，能夠快速準確的篩選出轉化子。由于篩選標記不為抗生素，因而為食品安全級的載體。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。1、材料限制性內切酶購自Takara；質粒提取試劑盒（B518188）、DNA連接酶、卡那霉素購自上海生物工程股份有限公司；含有質粒pPIC9K的大腸桿菌DH5α保藏于實驗室。人工合成的分別如SEQ ID NO.3、4所示的合成序列1、合成序列2。2、質粒pPIC9K的提取含有表達質粒pPIC9K的大腸桿菌DH5α，在LB培養基中（添加10μg/mL卡那霉素）培養12h，培養溫度為30℃，用質粒提取試劑盒（B518188）提取質粒。提取步驟如下：（1）取0.5mL菌液，10000rpm離心3min收集菌體，倒盡或吸干培養基。（2）在菌體沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體，室溫放置3min。（3）將裂解液全部小心移入吸附柱，室溫放置1min，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。（6）重復向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。（7）將吸附柱和收集管放入離心機，8000rpm離心2min。（8）將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室溫靜置2min，8000 rpm離心2min。將所得到的質粒DNA溶液置于-20℃保存。3、質粒pPIC9K和SEQ ID NO.3所示合成序列1的酶切往25μL提取的質粒pPIC9K中加入SnaBI和EcoR I酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及雙蒸水24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到質粒pPIC9K酶切液。合成序列1用雙蒸水稀釋10倍，取25μL，加入SnaBI和EcoR I酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及雙蒸水24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到序列1酶切液。4、酶切液電泳（1）電泳試劑配制1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，將pH調到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用時稀釋5倍。2）加樣緩沖液的配制：0.25%溴酚藍，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。3）溴化乙錠的配制：稱取0.1g溴化乙錠，溶于10mL水，配成終濃度為10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色時，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其終濃度為0.5μg/mL，混合均勻。4）100×TE緩沖液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。稱取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調pH至8.0（大約加入鹽酸20mL），然后定容至1000mL。5）100×電泳緩沖液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸鈉，200mmol/L EDTA。稱取Tris 242.2g，無水乙酸鈉82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調pH至8.0（大約加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用時稀釋100倍。（2）電泳方法1）安裝電泳槽：將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺上，插上樣品梳。2）1%瓊脂糖凝膠的制備：稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化，取出搖勻。3）灌膠：將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。4）待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。5）加樣：將DNA樣品與加樣緩沖液按體積比4:1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加20μL，記錄樣品的點樣次序和加樣量。6）電泳：安裝好電極導線，點樣孔一端接負極，另一端接正極，打開電源，調電壓至3-本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種食品安全級載體，其特征在于：含有纖維素內切酶編碼基因、β?葡糖苷酶編碼基因。
【技術特征摘要】
1.一種食品安全級載體，其特征在于：含有纖維素內切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因。2.根據權利要求1所述的食品安全級載體，其特征在于：所述的纖維素內切酶編碼基因的序列如SEQ ID NO.1所示。3.根據權利要求1所述的食品安全級載體，其特征在于：所述的β-葡糖苷酶編碼基因的序列如SEQ ID NO.2所示。4.權利要求1所述的食品安全級載體的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：將纖維素內切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因克隆到載體上。5.根據權利要求4所述的食品安全級載體的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：將SEQ ID NO.3所示序列、SEQ ID ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：薛棟升，梁龍元，
申請(專利權)人：湖北工業大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42
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