細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的應用制造技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，具體公開了細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用，其作為免疫抗原能夠被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，應用于間接ELISA檢測時，具備較高的特異性和敏感性，臨床檢測符合率高達97.9％。以細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶為免疫抗原建立的檢測方法具有良好的診斷效果，可以用于疫區綿羊細粒棘球蚴病的初步篩選。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，更具體的說是涉及細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的應用。
技術介紹
細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)屬帶科(Taeniidae)棘球屬(Echinococcus)，其中絳期幼蟲寄生于動物和人的肝、肺及其他器官內所引起細粒棘球蚴病，又稱囊性包蟲病，是一種人獸共患病，主要寄生在人和家畜等多種哺乳動物體內。90％以上的細粒棘球蚴包囊生長于宿主的肝臟、肺臟或者同時生長于肝肺。細粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的經濟和公共衛生問題。在一些流行地區，其感染率可高達5-10％，死亡率高達2-4％。據估計，全球人囊性棘球蚴病每年至少損失1-3.6百萬傷殘調整生命年(DALYs)，而動物囊性棘球蚴病每年造成的經濟損失至少為20億美元。因此，世界衛生組織已經把棘球蚴病列為《被忽視的熱帶疾病》，作為其2008-2015年重點防治計劃。目前，細粒棘球蚴病免疫診斷的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分復雜，具有難以大量提純、抗原來源不穩定、成本高、診斷特異性低等缺陷。缺乏標準有效的特異性重組抗原是細粒棘球蚴病免疫診斷中的一個尚未解決的難題。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于提供細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶(Eg-lap)的應用，使其能夠能被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性，并具有較高的特異性和敏感性，減少與其他帶科絳蟲病陽性血清的交叉反應。亮氨酸氨基肽酶(LAPs)具有水解N末端氨基酸的功能，屬于M1或者M17基因家族，并且在調節合成代謝和分解代謝、維持細胞形態、生長和免疫方面具有重要的作用。LAPs是金屬肽酶；有Mn2+，Co2+，或者Ni2+離子存在時能提高該酶的活性。LAPs在較高溫度(60-70℃)和偏堿的PH(8.5-9.5)條件下仍然具有穩定性。葡萄球菌的LAP參與葡萄球菌的生物膜形成和生長，表明LAP對在細菌生長和致病機理潛在的重要性。目前，關于亮氨酸氨基肽酶的研究在寄生蟲、線蟲和瘧原蟲上有一些功能性的報道，但是關于免疫抗原識別的研究還未見任何報道。因此，本專利技術對細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶(Eg-lap)進行了生物信息學分析，并通過反轉錄表達出rEg-lap蛋白，制備出抗rEg-lap的多克隆抗體，對該蛋白進行免疫印跡分析表明其可被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性，利用rEg-lap蛋白建立細粒棘球蚴病間接ELISA診斷方法，為細粒棘球蚴病的防控提供監測手段。因此，本專利技術提出了細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用。其中，作為優選，所述試劑盒為ELISA檢測試劑盒或免疫印跡檢測試劑盒。同時，本專利技術還提供了一種檢測細粒棘球蚴病的ELISA檢測試劑盒，包括細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶(作為抗原進行包被)和ELISA檢測試劑盒常規組分。所述試劑盒依據間接ELISA檢測原理。作為優選，所述ELISA檢測試劑盒常規組分包括抗原包被液、酶標板、封閉液、HRP標記的二抗和TMB底物。進一步優選地，所述封閉液為5％脫脂奶粉；所述HRP標記的二抗為HRP標記的山羊或綿羊抗兔二抗。在具體的ELISA檢測過程中，抗原包被最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.14μg/每孔，最佳血清稀釋濃度為1:80，血清孵育最佳時間是37℃1h，二抗孵育最佳時間是37℃1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000。作為優選，所述ELISA檢測試劑盒常規組分還包括顯色反應終止液H2SO4、洗滌液PBST和稀釋液PBS。本專利技術先提取細粒棘球絳蟲總RNA，而后進行反轉錄獲得cDNA，根據Eg-lap的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物擴增目的片段，然后進行測序驗證。最后連接至表達載體中，轉入大腸桿菌中表達，獲得細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的反轉錄重組蛋白rEg-lap。免疫印跡顯示rEg-lap能被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性。間接ELISA結果顯示，該方法的cut-off值為0.4952，特異性和敏感性分別為78.5％(11/14)和95.8％(23/24)。由以上技術方案可知，本專利技術提供了細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用，其作為免疫抗原能夠被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，應用于間接ELISA檢測時，具備較高的特異性和敏感性，臨床檢測符合率高達97.9％。以細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶為免疫抗原建立的檢測方法具有良好的診斷效果，可以用于疫區綿羊細粒棘球蚴病的初步篩選。附圖說明圖1所示為Eg-lap PCR擴增凝膠圖；其中，M為DNA分子質量標準DL2000；1為Eg-lap cDNA PCR產物；圖2所示為rEg-lap的western blot凝膠圖；其中，M為蛋白質標準品；1為IPTG誘導的含pET28a(+)-Eg-LAP的細菌；2為純化后的rEg-lap；圖3所示為rEg-lap的western blot凝膠圖；其中，M為蛋白質標準品；1為自然感細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別rEg-lap；2為健康綿羊血清識別rEg-lap；圖4所示為間接ELISA對不同血清的檢測結果；其中，橫坐標從左至右依次為綿羊抗細粒棘球蚴陽性血清、綿羊抗腦多頭蚴陽性血清、山羊抗細頸囊尾蚴陽性血清；Cuto-off value表示臨界值；圖5所示為間接ELISA對不同血清的檢測結果；其中，橫坐標從左至右依次為陽性血清和陰性血清；Cuto-off value表示臨界值。具體實施方式本專利技術公開了細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本專利技術。本專利技術所述應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
技術實現思路
、精神和范圍內對本文所述的應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本專利技術技術。在本專利技術具體實施方式中，各試驗所涉及的材料和試劑如下：1、主要試劑動物組織總RNA抽提試劑盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)和反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，購自GIBCOBRL公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性內切酶(BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTA Agarose，購自Qiagen公司；TaqPCR MasterMix、質粒小量抽提試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體，HRP標記的兔抗山羊IgG抗體，HRP標記的兔抗綿羊IgG抗體，FITC標記的羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，購自Bio-Rad公司，PCR引物合成和測序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它試劑均為國產分析純。2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用。

【技術特征摘要】
1.細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用。2.根據權利要求1所述應用，其特征在于，所述試劑盒為ELISA檢測試劑盒或免疫印跡檢測試劑盒。3.一種檢測細粒棘球蚴病的ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包括細粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶和ELISA檢測試劑盒常規組分。4.根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述ELISA檢測試劑盒常規組...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊光友，閆敏，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：四川;51