融合蛋白及其在治療艱難梭菌相關(guān)疾病中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了融合蛋白及其在治療艱難梭菌相關(guān)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了一種組合物，由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB、艱難梭菌芽孢抗原BclA3和艱難梭菌黏附分子CD0873組成。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明了該組合物免疫小鼠，具有良好的免疫原性，其抗血清具有良好的針對(duì)毒素的中和活性，可顯著減少艱難梭菌在腸道的定植，并可保護(hù)小鼠在艱難梭菌感染中存活。

Fusion proteins and their use in the treatment of Clostridium difficile associated diseases

Fusion proteins and their use in the treatment of Clostridium difficile associated diseases. The present invention provides a composition by Clostridium difficile toxin A C receptor binding region TcdA, Clostridium difficile toxin B C receptor binding region TcdB, Clostridium difficile spores of Clostridium difficile antigen BclA3 and adhesion molecule CD0873. The experimental results show that the composition of immunized mice has good immunogenicity, the antiserum has good neutralizing activity against toxins, can significantly reduce the Clostridium difficile in the colonization of the intestinal tract, and can protect mice survival in Clostridium difficile infection.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物
，尤其涉及融合蛋白及其在治療艱難梭菌相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
艱難梭菌(Clostridium difficile，C.difficile)，硬壁菌門(mén)，梭菌目，屬革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，在自然環(huán)境中廣泛存在，只感染哺乳動(dòng)物，通過(guò)糞-口途徑傳播。其芽孢生命力強(qiáng)，能抵抗多數(shù)消毒劑和殺菌劑，導(dǎo)致其能在醫(yī)療保健環(huán)境中廣泛傳播。現(xiàn)已成為醫(yī)院最主要的病原菌，每年造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，是25％以上抗生素相關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea，AAD)的病因。輕微的艱難梭菌感染可致艱難梭菌性腹瀉(Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD)，自限性腹瀉，嚴(yán)重者可發(fā)展為敗血癥、中毒性巨結(jié)腸、腹膜炎和偽膜性腸炎(pseudomembranous colitis，PMC)，暴發(fā)性感染的致死率達(dá)50％以上。同時(shí)由于芽孢的存在，康復(fù)病人體內(nèi)的芽孢可能再次萌發(fā)使病人病情反復(fù)。艱難梭菌感染以前主要院內(nèi)傳播，現(xiàn)已擴(kuò)展至社區(qū)傳播。自1978年首次發(fā)現(xiàn)該菌與偽膜性腸炎(pseudomembranous colitis，PMC)有關(guān)以后引起重視。2003年起核糖體027型(簡(jiǎn)稱(chēng)RT027)新菌株在多個(gè)國(guó)家暴發(fā)流行，造成大量死亡案例，中國(guó)也報(bào)道了散發(fā)病例。RT027因發(fā)生變異，傳染性和耐藥性增強(qiáng)，造成的死亡率、發(fā)病率也高于以往。很多國(guó)家將艱難梭菌作為法定傳染病必報(bào)的監(jiān)測(cè)病原。疫苗被認(rèn)為是控制CDI(C.difficile infection)最根本有效的措施。艱難梭菌最重要的毒力因子是腸毒素毒素A(308kDa)和細(xì)胞毒素毒素B(270kDa)。近年來(lái)對(duì)這兩種毒素及其基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、致病機(jī)理、調(diào)節(jié)機(jī)制等都取得了突破性進(jìn)展。毒素A和毒素B的C-端都由多個(gè)重復(fù)序列構(gòu)成，是毒素識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞受體的功能區(qū)，稱(chēng)為受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain，RBD)，重復(fù)序列的多少直接影響毒素與細(xì)胞表面受體的結(jié)合力強(qiáng)弱。研究表明，控制這兩種毒素的毒性對(duì)抵御CDI有效，圍繞這兩種毒素制備的保護(hù)性抗原或抗體也證明具有良好的效果。在某些菌體上附有細(xì)長(zhǎng)并呈波狀彎曲的絲狀物，少則1-2根，多則可達(dá)數(shù)百根。這些絲狀物稱(chēng)為鞭毛，是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官。鞭毛在細(xì)菌的致病中發(fā)揮重要作用：(1)促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附；(2)增強(qiáng)細(xì)菌向營(yíng)養(yǎng)更豐富處的運(yùn)動(dòng)能力；(3)促進(jìn)生物膜的形成；(4)促進(jìn)毒力因子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)；(5)通過(guò)激活TLR-5信號(hào)通路調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。以往研究表明艱難梭菌鞭毛在細(xì)菌定植中發(fā)揮重要作用。艱難梭菌基因組F1區(qū)段編碼的FliC和帽蛋白FliD是具有完整功能鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白。在艱難梭菌感染病人血清中可以檢測(cè)到抗FliC和FliD的抗體存在。某些細(xì)菌(芽孢桿菌，梭狀芽孢桿菌，少數(shù)球菌等)在其生長(zhǎng)發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成的一個(gè)圓形或橢圓形、厚壁、含水量低、抗逆性強(qiáng)的休眠體構(gòu)造，稱(chēng)為芽孢。艱難梭菌芽孢的直徑大于菌體直徑，使整個(gè)菌體呈梭形，位于菌體中間。艱難梭菌的致病依賴(lài)芽孢的形成。不能形成芽孢的艱難梭菌無(wú)法在腸道定植，也不能水平傳播。芽孢還可以抵御抗生素和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。艱難梭菌芽孢分多層，從內(nèi)向外分別為內(nèi)膜層、菌壁層、皮質(zhì)層、外膜層、包膜層和外壁層。BclA3是外壁層重要的組成成分，在艱難梭菌芽孢形成中發(fā)揮重要的作用。細(xì)菌表面存在的一些特殊結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白質(zhì)，具有使細(xì)菌粘附到宿主靶細(xì)胞的作用，稱(chēng)為粘附素(adhesin)。粘附是病原菌接觸和感染細(xì)胞的第一步，與致病性密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，相較于低致病株艱難梭菌，高致病株可以更好的黏附在宿主靶細(xì)胞。CD0873是最近新發(fā)現(xiàn)的艱難梭菌粘附素，在艱難梭菌致病中發(fā)揮重要作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。本專(zhuān)利技術(shù)提供的產(chǎn)品，包括如下1)-6)中任一種:1)融合蛋白組合物，所述融合蛋白組合物由融合蛋白A和融合蛋白B組成；所述融合蛋白A包括艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA和艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB；所述融合蛋白B包括如下至少1種蛋白：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；2)融合蛋白，所述融合蛋白由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和如下至少一種蛋白融合組成：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；3)蛋白組合物，所述蛋白組合物由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和如下至少一種蛋白組成：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；4)DNA分子，為2)所述融合蛋白的編碼DNA分子5)DNA分子組合物，由1)所示融合蛋白組合物中的融合蛋白A的編碼DNA分子和3)所示融合蛋白組合物中的融合蛋白B的編碼DNA分子組成；6)含有4)或5)的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。上述產(chǎn)品中，所述融合蛋白中各蛋白均通過(guò)連接肽連接。上述產(chǎn)品中，1)融合蛋白組合物中，所述融合蛋白A由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、連接肽和艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB融合得到的蛋白；所述融合蛋白B由艱難梭菌芽孢抗原BclA3、連接肽和艱難梭菌黏附分子CD0873融合得到的蛋白；3)蛋白組合物，為如下3)-A至3)-E中任一種：3)-A由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和艱難梭菌芽孢抗原BclA3組成；3)-B由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和艱難梭菌黏附分子CD0873組成；3)-C由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD組成；3)-D由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB、艱難梭菌芽孢抗原BclA3和艱難梭菌黏附分子CD0873組成；3)-E由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB、艱難梭菌芽孢抗原BclA3和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD組成；3)-F由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB、艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD組成。上述產(chǎn)品中，所述融合蛋白A)的氨基酸序列為如下a或b：a為從N末端依次由所述艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB氨基酸序列、所述連接肽氨基酸序列、所述艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA氨基酸序列組成；b為從N末端依次由所述艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA氨基酸序列、所述連接肽氨基酸序列、所述艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB氨基酸序列組成；所述融合蛋白B)的氨基酸序列為如下c或d：c為從N末端依次由所述艱難梭菌芽孢抗原BclA3氨基酸序列、所述連接肽氨基酸序列和所述艱難梭菌黏附分子CD0873氨基酸序列組成的蛋白組成；d為從N末端依次由所述艱難梭菌黏附分子CD0873氨基酸序列、所述連接肽氨基酸序列和所述艱難梭菌芽孢抗原BclA3氨基酸序列本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種產(chǎn)品，包括如下1)?6)中任一種:1)融合蛋白組合物，所述融合蛋白組合物由融合蛋白A和融合蛋白B組成；所述融合蛋白A包括艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA和艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB；所述融合蛋白B包括如下至少1種蛋白：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；2)融合蛋白，所述融合蛋白由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和如下至少一種蛋白融合組成：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；3)蛋白組合物，所述蛋白組合物由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和如下至少一種蛋白組成：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；4)DNA分子，為2)所述融合蛋白的編碼DNA分子5)DNA分子組合物，由1)所示融合蛋白組合物中的融合蛋白A的編碼DNA分子和3)所示融合蛋白組合物中的融合蛋白B的編碼DNA分子組成；6)含有4)或5)的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種產(chǎn)品，包括如下1)-6)中任一種:1)融合蛋白組合物，所述融合蛋白組合物由融合蛋白A和融合蛋白B組成；所述融合蛋白A包括艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA和艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB；所述融合蛋白B包括如下至少1種蛋白：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；2)融合蛋白，所述融合蛋白由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和如下至少一種蛋白融合組成：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；3)蛋白組合物，所述蛋白組合物由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和如下至少一種蛋白組成：艱難梭菌芽孢抗原BclA3、艱難梭菌黏附分子CD0873和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD；4)DNA分子，為2)所述融合蛋白的編碼DNA分子5)DNA分子組合物，由1)所示融合蛋白組合物中的融合蛋白A的編碼DNA分子和3)所示融合蛋白組合物中的融合蛋白B的編碼DNA分子組成；6)含有4)或5)的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述融合蛋白中各蛋白均通過(guò)連接肽連接。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的產(chǎn)品，其特征在于：1)融合蛋白組合物中，所述融合蛋白A由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、連接肽和艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB融合得到的蛋白；所述融合蛋白B由艱難梭菌芽孢抗原BclA3、連接肽和艱難梭菌黏附分子CD0873融合得到的蛋白；3)蛋白組合物，為如下3)-A至3)-E中任一種：3)-A由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和艱難梭菌芽孢抗原BclA3組成；3)-B由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和黏附分子CD0873組成；3)-C由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB和鞭毛蛋白FliD組成；3)-D由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB、艱難梭菌芽孢抗原BclA3和艱難梭菌黏附分子CD0873組成；3)-E由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdA、艱難梭菌B毒素C端受體結(jié)合區(qū)TcdB、艱難梭菌芽孢抗原BclA3和艱難梭菌鞭毛蛋白FliD組成；3)-F由艱難梭菌A毒素C端受體結(jié)合...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王慧，劉坤，李濤，王德慧，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11