一種嵌合抗原受體、表達其的細胞及其制備方法和用途技術

本發明專利技術涉及一種嵌合抗原受體，編碼其的核酸，含有該核酸的構建體、表達載體和轉化的細胞，以及它們的制藥用途。本發明專利技術的嵌合抗原受體包含至少一個胞外結構域、任選的跨膜結構域及至少一個胞內信號傳導結構域，其中所述胞外結構域包含衍生自MUC1或PSCA特異性的單克隆抗體的重鏈及輕鏈的SC?FV片段或基于該結構域進行的基因改造和任選的信號肽，所述胞內信號傳導結構域包含免疫共刺激信號組合。本發明專利技術所述轉化的細胞，其體外、體內殺傷實體腫瘤細胞的能力顯著增強，且高于常規第二代結構的嵌合抗原受體。

Chimeric antigen receptor, cell expressing the same, preparation method and application thereof

The invention relates to a chimeric antigen receptor, nucleic acid encoded by the same, a construct containing the nucleic acid, an expression vector and transformed cells, and their pharmaceutical use. Signal transduction domain transmembrane domain chimeric antigen receptor of the invention comprises at least one extracellular domain, and optionally at least one intracellular signal peptide, wherein the extracellular domain contains heavy and light chain monoclonal antibody derived from MUC1 or PSCA, the specificity of the SC fragment of FV or based on the domain of gene transformation and optionally, signal transduction domain contains the intracellular costimulatory signal combination. In vitro and in vivo, the ability of the transformed cells to kill solid tumor cells is significantly enhanced, and is higher than that of the conventional second generation chimeric antigen receptor.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及腫瘤的細胞免疫治療
，尤其涉及一種嵌合抗原受體，編碼其的核酸，含有該核酸的構建體、表達載體和轉化的細胞，以及它們的制藥用途。
技術介紹
近年來，肺癌的發病率與致死率都在不斷提高，使其持續成為全球范圍內最嚴重的癌癥類型之一。特別是在中國，近十幾年來肺癌發病率攀升得很快，這主要是因為吸煙人數快速增加(大多是男性)，據統計每天約有三千人死于吸煙[1]。肺癌主要分為小細胞肺癌(15％)和非小細胞肺癌兩大類，其中非小細胞肺癌又可分為腺癌(40％)、鱗狀細胞癌(30％)和大細胞癌(15％)。不同類型的肺癌，治療策略和預后情況也不盡相同，其中約70％-80％的患者被確診為非小細胞肺癌。臨床上非小細胞肺癌的治療方案主要包括外科手術切除治療、放療、化療、中醫藥治療以及分子靶向治療為代表的新型治療方案。然而，盡管目前的診斷與治療技術已經突飛猛進，許多肺癌仍舊在后期才得發現。大約80％的肺癌病人在發現時已進入晚期轉移期，無法進行手術切除。在可治療的月20％的病例中，后期往往也會復發，五年生存率很低。而且非小細胞肺癌對放療、化療的敏感性較差，治療效果不好。肺癌的靶向性治療主要是針對EGFR、ALK等基因突變，不過，目前靶向性藥物的效果還比較短暫，差不多一年腫瘤就會獲得抗性。看來，根據肺癌患者的遺傳學特征進行靶向性治療，還是一個艱巨的任務。因此，尋找有效地治療方法以及更加有效的肺癌相關生物標記是當前肺癌治療亟須解決的問題。目前，腫瘤免疫治療CAR-T(嵌合抗原受體T細胞免疫療法)是繼手術、化療、放療和靶向療法之后出現的一種新型治療方法，被稱為治療癌癥的“第五大療法”，近年來取得了越來越多的令人鼓舞的研究成果。世界各國都在積極開展CAR-T治療技術的臨床試驗，包括美國、英國、瑞典、中國、日本等。因此，CAR-T可作為治療肺癌的新型治療方法。CAR-T療法需要選擇腫瘤特異性或是腫瘤相關抗原作為其靶點。目前，還沒有發現肺癌的特異性抗原。因此，通過總結大量文獻，本專利選取MUC-1粘蛋白及PSCA為治療肺癌的靶點。粘蛋白MUC-1(Mucin 1)對上皮細胞更新、分化和完整性維持，癌癥發生和轉移等方面都起著重要作用。由于MUC1在腫瘤組織中的異常表達，使其成為一種重要腫瘤生物學標志物。MUC1廣泛分布并異常豐富地表達于癌細胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，癌細胞表面的MUC1多肽主鏈比正常細胞中的多肽主鏈更加暴露，因此成為免疫細胞攻擊靶點。PSCA在前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌等腫瘤中表達增加，在部分肺癌中也是高表達，PSCA作為腫瘤的免疫治療的靶點也顯示出其良好的臨床應用潛力。因此PSCA不僅成為腫瘤診斷和預后判斷的生物學標記也是腫瘤免疫治療重要的候選靶蛋白。基于目前肺癌治療的存在的問題和不足，例如：第一，大約80％的肺癌病人在發現時已進入晚期轉移期，無法進行手術切除。在可治療的約20％的病例中，后期往往也會復發，五年生存率很低；第二，非小細胞肺癌對放療、化療的敏感性較差，治療效果不好；第三，針對EGFR、ALK等基因突變的肺癌靶向性藥物的效果比較短暫，差不多一年腫瘤就會獲得抗性。因此，如能研究一種靶向PSCA及MUC1的嵌合抗原受體T細胞，并將其用于肺癌的治療，將有助于緩解過度的非特異免疫效應和細胞因子風暴等副作用，利于肺癌的有效治療。
技術實現思路
鑒于現有技術中存在的問題，本專利技術的目的在于提供一種嵌合抗原受體，編碼其的核酸，含有該核酸的構建體、表達載體和轉化的細胞，以及它們的制藥用途。本專利技術所述轉化的細胞，其體外、體內殺傷實體腫瘤細胞的能力顯著增強，且高于常規第二代結構的嵌合抗原受體，尤其適用于肺癌的治療。本專利技術者已生成包含衍生自MUC1或PSCA特異性單克隆抗體的scFV的MUC1或PSCA特異性CAR(CAR-PSCA；CAR-MUC1)，并驚人地發現將所述CAR-PSCA或CAR-MUC1通過轉染引入至原代T細胞中，在體外和體內檢測CAR T細胞的增殖，以及對肺癌細胞系及肺癌原代病人樣本的殺傷和效應功能，其對肺癌的殺傷效果較好，可以作為治療肺癌的新的并且有效的方法，為肺癌的治療開辟了新的道路。第一方面，本專利技術提供了一種嵌合抗原受體，其為靶向PSCA及MUC1的嵌合抗原受體，其包含至少一個胞外結構域、任選的跨膜結構域及至少一個胞內信號傳導結構域，其中所述胞外結構域包含衍生自MUC1或PSCA特異性的單克隆抗體的重鏈及輕鏈的SC-FV片段或基于該結構域進行的基因改造和任選的信號肽。根據本專利技術，所述任選的信號肽為所述嵌合抗原受體相對應的信號肽。本專利技術中，所述胞內信號傳導結構域包含免疫共刺激信號組合。本專利技術針對MUC-1的第二代和第三代CAR分子，命名為CAR-MUC1、CAR-MUC1T1和CAR-MUC1T2，和針對PSCA的第二代和第三代CAR分子，命名為CAR-PSCA、CAR-PSCAT1和CAR-PSCAT2。通過體外體內對肺癌細胞系殺傷實驗，發現以MUC1及PSCA為靶點的第二代CAR-T可以很好地殺傷肺癌細胞系。說明本專利技術提供的兩個抗原MUC1及PSCA可作為治療肺癌的有效靶點；此外，第三代CAR分子效果比第二代更好，說明本專利技術中第三代CAR結構要優于第二代CAR結構。因此，本專利技術提供了一種如前所述的嵌合抗原受體在制備與肺癌相關的疾病治療藥物中的應用，所述嵌合抗原受體作為靶點可以很好地殺傷肺癌細胞系。體外將以MUC-1及PSCA為靶點的CAR分子以一定的比例與肺癌細胞系A549等共培養，檢測它們的殺傷效果，以及細胞因子IFNgamma、IL-2、TNF-alpha的分泌水平。體內通過NOD/SCIDIL-2gamma-免疫缺陷小鼠檢測對照T細胞以及二代和三代CAR-T細胞對肺癌細胞系的殺傷活性。此外，在NOD/SCIDIL-2gamma-免疫缺陷小鼠構建肺癌原代病人PDX模型，以此模型驗證以MUC-1及PSCA為靶點的二代和三代CAR分子對肺癌的殺傷效果，均得出對肺癌殺傷效果較好的結果。優選地，所述免疫共刺激信號組合包含TLR1和/或TLR2信號結構域。進一步優選地，所述胞內信號傳導結構域為TLR1和/或TLR2與CD3ζ、CD28信號結構域的組合。優選地，所述TLR1和/或TLR2信號結構域配置在CD3ζ胞內結構域的C末端側。優選地，所述CD28信號結構域配置在CD3ζ胞內結構域的N末端側。第二方面，本專利技術提供了編碼如第一方面所述的嵌合抗原受體的核酸。第三方面，本專利技術提供了一種核酸構建體，其包含如第二方面所述的核酸，以及與之可操作連接、可指導所述嵌合抗原受體在宿主細胞中表達的一個或多個控制序列。第四方面，本專利技術提供了一種表達載體，其包含如第三方面所述的核酸構建體；優選地，所述表達載體為慢病毒。第五方面，本專利技術提供了一種轉化的細胞，其包含如第二方面所述的核酸，或者其中轉化了如第三方面所述的核酸構建體或如第四方面所述的表達載體。優選地，所述轉化的細胞為免疫細胞，進一步優選為T細胞、B細胞、NK細胞或其組合，例如可以是T細胞、B細胞或NK細胞中的任意一種，或者是T細胞、B細胞、NK細胞中的任意兩種或三種的組合。第六方面，本專利技術提供了制備如第五方面所述的轉化的細胞的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種嵌合抗原受體，其包含至少一個胞外結構域、任選的跨膜結構域及至少一個胞內信號傳導結構域，其中所述胞外結構域包含衍生自MUC1或PSCA特異性的單克隆抗體的重鏈及輕鏈的SC?FV片段或基于該結構域進行的基因改造和任選的信號肽。優選地，任選的信號肽為所述嵌合抗原受體相對應的信號肽。

【技術特征摘要】
1.一種嵌合抗原受體，其包含至少一個胞外結構域、任選的跨膜結構域及至少一個胞內信號傳導結構域，其中所述胞外結構域包含衍生自MUC1或PSCA特異性的單克隆抗體的重鏈及輕鏈的SC-FV片段或基于該結構域進行的基因改造和任選的信號肽。優選地，任選的信號肽為所述嵌合抗原受體相對應的信號肽。2.如權利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述胞內信號傳導結構域包含免疫共刺激信號組合；優選地，所述免疫共刺激信號組合包含TLR1和/或TLR2信號結構域；進一步優選地，所述胞內信號傳導結構域為TLR1和/或TLR2與CD3ζ、CD28信號結構域的組合。3.如權利要求2所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述TLR1和/或TLR2信號結構域配置在CD3ζ胞內結構域的C末端側；優選地，所述CD28信號結構域配置在CD3ζ胞內結構域的N末端側。4.編碼如權利要求1-3任一項所述的嵌合抗原受體的核酸。5.一種核酸構建體，其包含如權利要求4所述的核酸，以及與之可操...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李鵬，魏新茹，賴允鑫，秦樂，林思妙，
申請(專利權)人：深圳市體內生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44