血漿中氨基酸分析用內標液、內標物質及血漿中氨基酸的定量方法技術

一種血漿中氨基酸分析用內標液、內標物質及血漿中氨基酸的定量方法。該血漿中氨基酸分析用內標液含有利用1種以上的穩定同位素進行過標記的脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺，其中牛磺酸的濃度為最高濃度。

Method for quantitative determination of amino acids in plasma and internal standard substances and amino acids in blood plasma

Internal standard solution, internal standard substance and method for quantitative determination of amino acids in plasma. The plasma amino acid analysis using internal standard solution containing of labeled proline, glycine, valine, methionine, tryptophan, tyrosine, taurine, isoleucine, phenylalanine and asparagine with stable isotopes of more than 1, of which the concentration is the highest concentration of taurine.

【技術實現步驟摘要】
本申請是申請號為201280035466.4(國際申請號為PCT/JP2012/068302)、中國國家階段進入日為2014年1月17日(國際申請日為2012年7月19日)、專利技術名稱為“血漿中氨基酸分析用標準液”的中國專利技術專利申請的分案申請。
本專利技術涉及氨基酸分析用標準液，特別是涉及外標物或內標物用途的標準液、以及使用了該標準液的氨基酸定量方法。
技術介紹
近年來，已知生物體內的代謝物不僅受遺傳因素的影響，還大大受到環境因素的影響，這些代謝物的分析與基因、蛋白質的分析同樣地被作為疾病診斷和健康狀態的指標而受到關注。其中，氨基酸、胺等氨基酸相關化合物是最廣泛存在的代謝物組之一(例如非專利文獻1)，自古以來就對其進行定量分析，并且開發出各種各樣的分析方法。另一方面，在定量分析中，一般使用標準曲線法，該標準曲線法通常對覆蓋著分析對象化合物的測定點的2種以上濃度的標準物質進行分析來制作標準曲線。在利用這樣的標準曲線法的定量分析中，使用已知濃度的外標物預先求出濃度與信號(signal，具體來說表示為峰面積、峰高等)的相關關系，根據其中所得到的信息(即標準曲線)求出檢測樣品中的濃度。因此，在使用標準曲線法的定量分析中以由外標(基準)得到的標準曲線作為基準，因而為了進行高精度的解析，定量用的標準品極為重要。并且，為了高精度地進行利用標準曲線法的定量分析，準備多個不同濃度系列的標準品，實際測定這些標準品來制作標準曲線，并且檢測樣品中的測定對象的濃度處于標準曲線制作中使用的標準品的濃度之間對于進行高精度定量而言是重要的。具體來說，如果檢測樣品中的對象的濃度為50μM(μmol/l)的樣本，則優選使用從25μM到75μM的標準品。進一步，此時的標準品的校準點(測定點)的范圍窄時更容易確保濃度與信號的線性，因而是優選的。更具體來說，相比于在1μM到100μM間取校準點，優選在25μM至75μM間取校準點。然而，生物體內的氨基酸(氨基酸相關化合物)的種類較多。例如，在SRL公司的氨基酸分析的檢查項目中，舉出了39種氨基酸相關化合物作為分析對象(例如非專利文獻2)。并且，已知生物體內的氨基酸濃度因氨基酸的種類而大大不同，濃度高的氨基酸和濃度低的氨基酸之間存在100倍左右(2數量級)的濃度差。因此，使用已有的混合標準液[例如，氨基酸混合標準液AN-II型(代碼編號：015-14461、011-14463)、B型(代碼編號：016-08641、012-08643)、H型(代碼編號：013-08391、019-08393)等(均由和光純藥工業株式會社銷售)]進行分析時，存在需要根據各氨基酸相關化合物的濃度范圍對標準物質或檢測樣品進行稀釋等需要花費工夫進行準備的問題。另一方面，已有關于針對人血漿中的氨基酸的參考標準物質的報告(非專利文獻3)，該報告中的標準物質為由非特定多數的100名美國男女得到的血漿混合而成的血漿池，因此無法避免批次間的濃度值的偏差。另外，將其用作標準液進行氨基酸測定時，該標準物質中含有的各種氨基酸的濃度為100人的平均值，因而樣本的氨基酸濃度超過平均值時，該濃度脫離標準曲線的范圍，在測定精度方面欠缺可靠性。進一步，該標準物質含有氨基酸以外的各種生物體物質，因此無法否定因這些物質對測定值產生影響的可能性，在用作用于高精度定量分析的標準物質時存在問題。因此，期望開發出一種標準物質，其不需要根據所測定的氨基酸的種類調整濃度，使用適當稀釋1種溶液而成的物質就能夠制作可以對來自生物體的樣本中的各種氨基酸能夠進行高精度定量的標準曲線。進一步，使用標準曲線法的定量分析法中有所謂的外標法和內標法等，而對于內標物質來說，與外標物質一樣通過匹配檢測樣品的特性來設計標準物質，從而可以提高定量精度。特別是將質譜儀作為檢測器時，樣品中的基質效應的影響較大，使用內標物質在高精度測定方面非常重要。關于使用該內標法的氨基酸測定已有多項研究報道(例如非專利文獻4、5)，以往的內標物質的濃度與信號的線性差，使用這些內標物質時具有氨基酸的測定精度不良等問題。因此，期望開發克服了這類問題的內標物質。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：WO2003/069328非專利文獻非專利文獻1：B.D.Bennett,E.H.Kimball,M.Gao,R.Osterhout,S.J.Van Dien and J.D.Rabinowitz,Nat.Chem.Biol.,5,593-599(2009).非專利文獻2：http：//www.srl.info/srlinfo/kensa_ref_CD/KENSA/SRL6354.htm非專利文獻3：http：//www.nist.gov/cstl/analytical/organic/metabolitesinserum.cfm非專利文獻4：Kazutaka Shimbo,Takashi Oonuki,Akihisa Yahashi,Kazuo Hirayama and Hiroshi Miyano,Rapid Commun.Mass Spectrom.2009；23:1483-1492.非專利文獻5：E.A.McGaw,K.W.Phinney and M.S.Lowenthal.J Chromatogr A.2010；1217:5822-5831.
技術實現思路
專利技術要解決的問題本專利技術是鑒于上述狀況而完成的，本專利技術要解決的問題在于簡便且高精度地實施氨基酸的定量。更具體來說，本專利技術的課題為提供用于對血漿中存在的氨基酸的定量分析簡便且高精度地進行分析的外標液、外標物質、內標液和內標物質以及使用了這些物質的血漿中氨基酸的定量方法。用于解決問題的手段本專利技術人為了解決上述課題，首先通過對6469份樣本的人血漿樣本中的各種氨基酸濃度進行分析，以統計學的方式求出了作為基準的人血漿中的各氨基酸的濃度分布。并且，以該濃度分布為基礎制備了外標液。其結果發現，該外標液與以往不同，若使用該外標液和將其進行適當稀釋而成的溶液制作標準曲線，則大多數樣本中的各種氨基酸濃度會落入使用了這些外標液的標準曲線內，因而能夠高精度地測定樣本中的氨基酸濃度，從而完成了本專利技術。進一步，本專利技術人發現，例如使用以質譜儀作為檢測器的液相色譜時，使用以穩定同位素標記過的特定氨基酸作為內標物質，由此內標物質的濃度與信號的關系為直線，能夠進行高精度地氨基酸分析，從而完成了本專利技術。即，本專利技術的血漿中氨基酸分析用外標液(以下有時僅簡稱為本專利技術的外標液)基于由6469份樣本的樣本數據得到的血漿中的各種氨基酸濃度分布，按照實際的血漿中的濃度平衡含有各種氨基酸，將該標準液用于制作氨基酸的定量分析的標準曲線，由此，制作出的標準曲線的濃度差可以覆蓋實際的血漿中氨基酸濃度的最小濃度至最大濃度的大部分，從而發揮了可以比以往更簡便且高精度地進行氨基酸分析的效果。另外，本專利技術的外標液的特征在于，適于將例如液體色譜法、氣相色譜法、超臨界流體色譜法、電泳法、電感耦合等離子體法等與質譜分析組合而成的各種分離分析方法，特別適于利用組合了質譜分析的色譜法進行各種氨基酸的分離分析測定。即，在本專利技術的一種實施方式中，血漿中氨基酸分析用外標液的特征在于，其含有下述(1)和(2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種血漿中氨基酸分析用內標液，其特征在于，其含有利用1種以上的穩定同位素進行過標記的脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺，其中牛磺酸的濃度為最高濃度。

【技術特征摘要】
2011.07.21 JP JP2011-1603641.一種血漿中氨基酸分析用內標液，其特征在于，其含有利用1種以上的穩定同位素進行過標記的脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺，其中牛磺酸的濃度為最高濃度。2.一種血漿中氨基酸分析用內標液，其特征在于，其含有利用1種以上的穩定同位素進行過標記的脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、鳥氨酸、乙醇胺、谷氨酸、3-甲基組氨酸、絲氨酸、組氨酸和精氨酸，其中牛磺酸的濃度為最高濃度。3.一種血漿中氨基酸分析用內標液，其特征在于，其含有利用1種以上的穩定同位素進行過標記的脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和天...

【專利技術屬性】
技術研發人員：早川昌子，新保和高，吉田寬郎，
申請(專利權)人：和光純藥工業株式會社，味之素株式會社，
類型：發明
國別省市：日本;JP