檢測ELA2基因的方法和引物技術

本發明專利技術公開了一種檢測先天性中性粒細胞減少癥患者ELA2基因突變的引物和方法，其包括擴增ELA2基因全外顯子序列的引物；采用Sanger測序技術和測序引物。本發明專利技術可快速地將先天性中性粒細胞減少癥患者體內ELA2基因全外顯子的突變檢測出來。利用本發明專利技術完成的檢測結果準確，可以輔助診斷先天性中性粒細胞減少癥，對早期干預、早期治療和產前診斷有重要的參考意義。

Method and primer for detecting ELA2 gene

The invention discloses a method for detection of congenital neutropenia in patients with ELA2 primers and methods of gene mutations, including ELA2 gene significantly amplified the whole sequence primers; using Sanger sequencing and sequencing primers. The invention can quickly detect the mutation of the ELA2 gene exon in the patients with congenital neutropenia. The detection results of the invention can be used to assist in the diagnosis of congenital neutropenia, which has important reference significance for early intervention, early treatment and prenatal diagnosis.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生命科學和生物
，特別涉及檢測ELA2基因的引物和方法。
技術介紹
先天性中性粒細胞減少癥是一組異質性疾病，包括重型先天性中性粒細胞減少癥(SCN)、周期性中性粒細胞減少癥(CN)、網狀組織發育不全等一系列疾病。近年來研究表明ELA2基因在中性粒細胞減少癥中扮演重要角色。1999年Horwitz等確定CN的異常基因為19號染色體上的ELANE/ELA2基因，并且現在已確定幾乎所有的CN患者均存在ELA2基因的突變。2000年Dale等發現，大多數常染色體顯性遺傳的SCN患者中存在中性粒細胞彈性蛋白酶基因(ELANE/ELA2)的突變。ELA2基因位于19p13.3，由5個外顯子組成，參與編碼中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)。而NE是一種髓系細胞特異性絲氨酸蛋白酶，在中性粒細胞分化的早幼粒階段產生，存在于成熟中性粒細胞的初級顆粒中，參與切割降解多種細菌蛋白，在先天防御中發揮重要作用，當NE發生突變時將引發“未折疊蛋白反應”(UPR)使粒細胞凋亡。有試驗應用突變的ELA2基因轉染U037細胞可誘導UPR發生，研究表明ELA2突變所導致的細胞ER應激反應會引發UPR，增加分子伴侶、ER相關的降解和促凋亡基因的轉錄，最終導致細胞凋亡。由于ELA2基因在中性粒細胞凋亡中扮演如此重要的角色，因此開展ELA2基因的突變檢測項目顯得十分必要。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種檢測ELA2基因多態突變熱點的引物，采用PCR技術，可用于快速檢測ELA2綜合征患者體內ELA2基因多態位點的突變情況。所述檢測ELA2基因多態熱點突變情況的引物，包括：擴增ELA2基因的引物，其堿基序列為：ELA2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGACATTTGAATGCGATTGELA2-1R：AACAGCTATGACCATGGCACAGACAGACCTGGACTTGELA2-2/3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGCCTCAGTTTCCTCATCELA2-2/3R：AACAGCTATGACCATGCGTTTCACAGAGGTGCAGACELA2-4/5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGAGGGTCATCATCACTGELA2-4/5R：AACAGCTATGACCATGCATTTTCAACACCCAATCACA進一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：檢測ELA2基因的測序引物堿基序列為：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG進一步地，引物序列ELA2-1F和ELA2-1R是擴增ELA2基因第1外顯子序列的引物，引物序列ELA2-2/3F和ELA2-2/3R是擴增ELA2基因第2、3外顯子序列的引物，引物序列ELA2-4/5F和ELA2-4/5R是擴增ELA2基因第4、5外顯子序列的引物。本專利技術還提供了檢測ELA2基因全外顯子突變情況的方法，包括以下步驟：1.抽提血液/中的DNA；2.用PCR擴增步驟1中提取的DNA；3.對步驟2中的擴增產物進行測序；4.對測序結果進行判斷，確定ELA2基因是否發生突變；其中PCR擴增引物為：擴增ELA2基因的引物，其堿基序列為：ELA2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGACATTTGAATGCGATTGELA2-1R：AACAGCTATGACCATGGCACAGACAGACCTGGACTTGELA2-2/3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGCCTCAGTTTCCTCATCELA2-2/3R：AACAGCTATGACCATGCGTTTCACAGAGGTGCAGACELA2-4/5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGAGGGTCATCATCACTGELA2-4/5R：AACAGCTATGACCATGCATTTTCAACACCCAATCACA進一步地，測序引物堿基序列為：檢測ELA2基因的測序引物堿基序列為：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG本專利技術還提供了一種檢測ELA2基因多態突變位點的試劑盒，包括：(i)血液DNA抽提試劑；(ii)檢測體系PCR擴增反應液；(iii)測序體系試劑；其中PCR擴增反應液引物為：(ⅰ)擴增ELA2基因的引物，其堿基序列為：ELA2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGACATTTGAATGCGATTGELA2-1R：AACAGCTATGACCATGGCACAGACAGACCTGGACTTGELA2-2/3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGCCTCAGTTTCCTCATCELA2-2/3R：AACAGCTATGACCATGCGTTTCACAGAGGTGCAGACELA2-4/5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGAGGGTCATCATCACTGELA2-4/5R：AACAGCTATGACCATGCATTTTCAACACCCAATCACA進一步地，測序引物堿基序列為：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG有益效果：本專利技術設計了擴增ELA2全部5個外顯子序列的引物。通過加接頭，使所有3對引物的PCR產物均可以用一種測序引物進行測序。采用PCR技術，構建了穩定的擴增體系。通過調整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。ELA2基因的突變類型種類多且遍布整個基因，因此本專利技術所述引物既能將所述ELA2全外顯子序列都擴增出來，也保證無論這些外顯子的何處位置發生突變，都不會出現漏檢的情況。相比較熒光定量PCR法降低了檢測的成本和難度。熒光定量PCR法要針對不同的突變類型設計多個探針，成本高，檢測難度大。本專利技術設計的3對引物涵蓋了ELA2基因全部5個外顯子區域，在使用盡量少引物條件下確保了每對引物所擴增的產物長度低于1000bp，使得后續測序時的上下游引物均能測出目的片段，一定程度上保證了測序的準確性。附圖說明圖1為ELA2基因在染色體上定位圖圖2為ELA2-1F/R、ELA2-2/3F/R、ELA2-4/5F/R的電泳圖，M為Marker DL2000，1-3為送檢的血液樣本1-3號，如圖2所示，引物ELA2-1F/R、ELA2-2/3F/R、ELA2-4/5F/R擴增有效，且條帶單一。圖3、4、5分別為樣本1的ELA2第1、2/3、4/5號外顯子野生型測序截圖。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本專利技術。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例1一種檢測ELA2基因多態突變位點的引物，該引物的設計是針對ELA2全外顯子設計的擴增引物，包括：擴增ELA2基因全外顯子序列的引物，其堿基序列為：ELA2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGACATTTGAATGCGATTGELA2-1R：AACAGCTATGACCATGGCACAGACAGACCT本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測ELA2基因突變情況的引物，其特征在于，包括：擴增ELA2基因的引物，其堿基序列為：ELA2?1F：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGACATTTGAATGCGATTGELA2?1R：AACAGCTATGACCATGGCACAGACAGACCTGGACTTGELA2?2/3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGCCTCAGTTTCCTCATCELA2?2/3R：AACAGCTATGACCATGCGTTTCACAGAGGTGCAGACELA2?4/5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGAGGGTCATCATCACTGELA2?4/5R：AACAGCTATGACCATGCATTTTCAACACCCAATCACA。

【技術特征摘要】
1.檢測ELA2基因突變情況的引物，其特征在于，包括：擴增ELA2基因的引物，其堿基序列為：ELA2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGACATTTGAATGCGATTGELA2-1R：AACAGCTATGACCATGGCACAGACAGACCTGGACTTGELA2-2/3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGCCTCAGTTTCCTCATCELA2-2/3R：AACAGCTATGACCATGCGTTTCACAGAGGTGCAGACELA2-4/5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGAGGGTCATCATCACTGELA2-4/5R：AACAGCTATGACCATGCATTTTCAACACCCAATCACA。2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，還包括測序引物，所述測序堿基序列為：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。3.如權利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列ELA2-1F和ELA2-1R是擴增ELA2基因第1外顯子序列的引物，引物序列ELA2-2/3F和ELA2-2/3R是擴增ELA2基因第2、3外顯子序列的引物，引物序列ELA2-4/5F和ELA2-4/5R是擴增ELA2基...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林筱劍，陳奕磊，王淑一，
申請(專利權)人：武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北;42