一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。所述培養(yǎng)方法以生物碳作為吸附劑，以固氮細(xì)菌作為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)出的固氮細(xì)菌的均體密度達(dá)到5×1013～1×1015cfu/mL。所制得的發(fā)酵液可以經(jīng)過離心、噴霧干燥，干燥的菌體粉活菌量高達(dá)1015～1017cfu/g。所制得的固氮細(xì)菌可以用作生物肥料的活菌劑或與其他菌種共同作為生物肥料的活菌劑。

High density cultivation nitrogen fixing bacteria and preparation method and application thereof

The invention discloses a method for high density cultivation of nitrogen fixing bacteria and application thereof, which belongs to the field of bioengineering technology. The cultivation method for biological carbon as sorbent to nitrogen fixing bacteria as the starting strain, followed by in vitro culture expansion, liquid shake flask, seed tank culture expansion and liquid culture, cultivate the nitrogen fixing bacteria density reached 5 * 1013 ~ 1 * 1015cfu/mL. The fermented liquid can be centrifuged and spray dried, and the dried bacterial powder can reach 1015 to 1017cfu/g. The nitrogen fixing bacteria can be used as the living bacteria agent of the biological fertilizer or the microbial agent which can be used as the biological fertilizer together with other bacteria.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物工程
，具體地涉及一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
所謂生物碳，是由有機(jī)垃圾，如動(dòng)物糞便，動(dòng)物骨頭，植物根莖，木屑和麥秸稈等生物量經(jīng)過熱化學(xué)效應(yīng)，被高溫分解，成為可用做肥料的類似于碳球狀的物質(zhì)。其中由植物形成的，以固定碳元素為目的的木炭被稱為“生物碳”。土地中自然存在大量的碳元素，但是這些碳是不穩(wěn)定的，受氣候影響會(huì)釋放二氧化碳。而生物碳則可以固定碳元素長達(dá)幾百年。生活在巴西亞馬遜河流域的人們長期使用一種特殊的肥料。這種肥料來源于當(dāng)?shù)兀哂袠O強(qiáng)的恢復(fù)貧瘠土壤肥力的能力。當(dāng)?shù)厝税阉Q為“印第安人的黑土壤”。它多產(chǎn)、肥沃，與當(dāng)?shù)叵∈琛⒇汃さ耐寥佬纬甚r明的對(duì)比。現(xiàn)代研究證明，黑土壤是2500年，甚至6000年以前由生活在亞馬遜流域的人們制造的。一般認(rèn)為，他們使用的材料包括動(dòng)物糞便，魚，動(dòng)物骨頭和植物廢物。但是生產(chǎn)黑土壤最關(guān)鍵的原料，也是黑土壤之所以呈現(xiàn)黑色的原因，是木炭的使用。黑土壤中的木炭可以使土壤肥力維持一個(gè)世紀(jì)之久。幾個(gè)世紀(jì)以來，生活在南美亞馬遜流域的人們都靠這些原生態(tài)材料制造“黑土壤”來肥沃土地。幾千年過去了，那兒的土壤不需耕耘灌溉，依舊十分肥沃。佐治亞大學(xué)的科學(xué)家Steiner解釋道：“千百年過去，這個(gè)區(qū)域依舊沃土依然，那是因?yàn)橥寥乐懈缓荚亍薄Ｒ虼耍锾际谷藗兛吹搅藷o需砍伐森林也可開拓農(nóng)耕地的希望。生物碳可以保護(hù)環(huán)境。鑒于其高含碳量和多孔的特性，它不僅可提高土壤蓄水儲(chǔ)養(yǎng)的能力，還可保護(hù)土壤中的微生物。它像一個(gè)地下碳水槽，鎖住二氧化碳，最終達(dá)到增加作物產(chǎn)量的效果。生物碳可吸收有機(jī)物質(zhì)腐爛時(shí)釋放至大氣的二氧化碳，并幫助植物有效儲(chǔ)存其光合作用所需的二氧化碳。通過這兩種方式，生物碳起到了潔凈空氣的作用，是面向未來的、低成本的、可持續(xù)性的環(huán)保能源。固氮菌為細(xì)菌的一科。菌體桿狀、卵圓形或球形，無內(nèi)生芽孢，革蘭氏染色陰性，嚴(yán)格好氧性，屬于有機(jī)營養(yǎng)型，能固定空氣中的氮元素。包括共生固氮菌和自生固氮菌。共生固氮菌在與植物共生的情況下才能固氮或才能有效地固氮，固氮產(chǎn)物氨可直接為共生體提供氮源。主要有根瘤菌屬(Rhizobium)的細(xì)菌與豆科植物共生形成的根瘤共生體。根瘤菌生活在土壤中，以動(dòng)植物殘?bào)w為養(yǎng)料，過著“腐生生活”。當(dāng)土壤中有相應(yīng)的豆科植物生長時(shí)，根瘤菌迅速向它根部靠攏，從根毛彎曲處進(jìn)入根固氮菌部。豆科植物根部在根瘤菌的刺激下迅速分裂膨大，形成“瘤子”，為根瘤菌提供了理想的活動(dòng)場所，還供應(yīng)了豐富的養(yǎng)料，讓根瘤菌生長繁殖。根瘤菌又會(huì)從空氣中吸收氮?dú)猓瑸槎箍浦参镏谱鞯矗龠M(jìn)植物生長。因此根瘤菌也被稱為共生固氮菌。根瘤菌固定的氮源不僅滿足豆科植物的需要，還可以積累氮源滿足后續(xù)植物生長。還有一些固氮菌，如圓褐固氮菌，它們不在植物體內(nèi)，能自己從空氣中吸收氮?dú)猓敝澈蟠篮髮⒕w固定的氮源提供給植物，讓植物得到大量氮肥。這類固氮菌叫自生固氮菌。固氮菌肥料是利用固氮微生物將大氣中的分子態(tài)氮?dú)廪D(zhuǎn)化為農(nóng)作物能利用的氨，進(jìn)而為其提供合成蛋白質(zhì)所必需的氮素營養(yǎng)的肥料。微生物自生或與植物共生，將大氣中的分子態(tài)氮?dú)廪D(zhuǎn)化為農(nóng)作物可吸收的氨的過程，稱為生物固氮。生物固氮是在極其溫和的常溫常壓條件下進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)，不需要化肥生產(chǎn)中的高溫、高壓和催化劑，因此，生物固氮是最便宜、最干凈、效率最高的施肥過程。固氮菌肥料是最理想的、最有發(fā)展前途的肥料。目前固氮菌肥料的生產(chǎn)基本上采用液體發(fā)酵的方法，產(chǎn)品可分液體菌劑和固體菌劑。在發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)束后及時(shí)分裝即成液體菌劑，發(fā)酵好的液體再用滅菌的草炭等載體吸附劑進(jìn)行吸附即成固體菌劑。固氮菌肥料是含有固氮菌大量好氣性自身固氮菌的微生物肥料。自身固氮菌不與高等植物共生，沒有寄主選擇，而是獨(dú)立生存于土壤中，利用土壤中的有機(jī)質(zhì)或根系分泌的有機(jī)物作碳源來固定空氣中的氮素，或直接利用土壤中的無機(jī)氮化合物。固氮菌肥對(duì)棉花、水稻、小麥、花生、油菜、玉米、高粱、馬鈴薯、煙草、甘蔗以及各種蔬菜都有一定增產(chǎn)作用。現(xiàn)有高密度培養(yǎng)技術(shù)通常是通過外加設(shè)備，通過截留或連續(xù)培養(yǎng)獲得，這些技術(shù)不僅易污染，而且菌體濃度不高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、要解決的問題針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，本專利技術(shù)提供一種利用生物碳吸附，無需外加設(shè)備，而且可以實(shí)現(xiàn)分批高密度培養(yǎng)的方法，通過該方法培養(yǎng)硅酸鹽菌體密度可以達(dá)到1×1013～1×1015cfu/mL。2、技術(shù)方案為了解決上述問題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：本專利技術(shù)中一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的方法，所述制備方法以生物碳作為吸附載體，以固氮細(xì)菌作為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)等步驟；發(fā)酵液菌體濃度為1×1013～1×1015cfu/mL。所制備的發(fā)酵液可以經(jīng)過離心噴霧干燥，干燥的菌體粉活菌量達(dá)1015～1017cfu/g。所述的一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的方法，該方法所使用的生物碳原料可以是污泥、動(dòng)物糞便、動(dòng)物骨頭、植物根莖和木屑等生物量經(jīng)過熱化學(xué)效應(yīng)，被高溫分解得到的任意一種生物碳；所使用的固氮細(xì)菌菌種為褐球固氮菌、固氮菌、內(nèi)生固氮菌、大豆根瘤菌、花生根瘤菌中任一種。進(jìn)一步地，所述的一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的方法，其包括如下步驟：A1試管擴(kuò)大培養(yǎng)：將固氮細(xì)菌斜面菌種接種于固氮細(xì)菌斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制得固氮細(xì)菌試管斜面菌種；A2液體搖瓶培養(yǎng)：將步驟A1所制得的固氮細(xì)菌試管斜面菌種接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，制得固氮細(xì)菌液體搖瓶菌種；A3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟A2所制得的固氮細(xì)菌液體搖瓶菌種接種到種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制成固氮細(xì)菌種子罐菌種；A4液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟A3所制得的固氮細(xì)菌種子罐菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并混合均勻，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制得固氮細(xì)菌發(fā)酵液；A5干燥與包裝：固氮細(xì)菌發(fā)酵液經(jīng)過離心、噴霧干燥、包裝制得固氮細(xì)菌干粉。進(jìn)一步地，所述的一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的方法，其具體步驟為：B1試管擴(kuò)大培養(yǎng)：接種一環(huán)固氮細(xì)菌斜面菌種到固氮細(xì)菌試管斜面培養(yǎng)基中，25～40℃培養(yǎng)2～10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4℃保存?zhèn)溆茫籅2液體搖瓶培養(yǎng)：接種一環(huán)步驟B1所制得的試管斜面菌種接種于裝有20～150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為10～160轉(zhuǎn)/分，溫度25～40℃的條件下，搖床培養(yǎng)18～86h，制成固氮細(xì)菌液體搖瓶菌種；B3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟B2所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為0.2～10％的接種量接種，在溫度為25～40℃，攪拌轉(zhuǎn)速為10～120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為0.2～1.8:1的通氣量條件下，培養(yǎng)18～96h，制成固氮細(xì)菌種子罐菌種；B4液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟B3所制得的固氮細(xì)菌種子罐菌種按體積比為0.2～10％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25～40℃，攪拌轉(zhuǎn)速為10～120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為0.2～1.8:1的通氣量條件下，培養(yǎng)48～96小時(shí)，制得固氮細(xì)菌發(fā)酵液，該發(fā)酵液菌體濃度為1013～1015cfu/mL；B5干燥與包裝：將步驟B4所制得的固氮細(xì)菌發(fā)酵液4000～10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～30分鐘，調(diào)節(jié)菌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的制備方法，其特征在于所述制備方法以生物碳作為吸附載體，以固氮細(xì)菌作為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、噴霧干燥和包裝工藝制得。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的制備方法，其特征在于所述制備方法以生物碳作為吸附載體，以固氮細(xì)菌作為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、噴霧干燥和包裝工藝制得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的制備方法，其特征在于，所使用的生物碳原料是污泥、動(dòng)物糞便、動(dòng)物骨頭、植物根莖和木屑生物量經(jīng)過熱化學(xué)效應(yīng)，被高溫分解得到的任意一種生物碳；所使用的固氮細(xì)菌菌種可以是褐球固氮菌、固氮菌、內(nèi)生固氮菌、大豆根瘤菌和花生根瘤菌中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：A1試管擴(kuò)大培養(yǎng)：將固氮細(xì)菌斜面菌種接種于固氮細(xì)菌試管斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制得固氮細(xì)菌試管斜面菌種；A2液體搖瓶培養(yǎng)：將步驟A1所制得的固氮細(xì)菌試管斜面菌種接種到裝有含有生物碳的液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，制得固氮細(xì)菌液體搖瓶菌種；A3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟A2所制得的固氮細(xì)菌液體搖瓶菌種接種到種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制成固氮細(xì)菌種子罐菌種；A4液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟A3所制得的固氮細(xì)菌種子罐菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并混合均勻，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制得固氮細(xì)菌發(fā)酵液；A5干燥與包裝：固氮細(xì)菌發(fā)酵液經(jīng)過離心、噴霧干燥、包裝制得固氮細(xì)菌干粉。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高密度培養(yǎng)固氮細(xì)菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體如下：B1試管擴(kuò)大培養(yǎng)：接種一環(huán)固氮細(xì)菌斜面菌種到固氮細(xì)菌試管斜面培養(yǎng)基中，25～40℃培養(yǎng)2～10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4℃保存?zhèn)溆茫籅2液體搖瓶培養(yǎng)：接種一環(huán)步驟B1所制得的試管斜面菌種接種于裝有20～150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為10～160轉(zhuǎn)/分，溫度25～40℃的條件下，搖床培養(yǎng)18～86h，制成固氮細(xì)菌液體搖瓶菌種；B3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟B2所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為0.2～10％的接種量接種，在溫度為25～40℃，攪拌轉(zhuǎn)速為10～120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為0...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：俞建國，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河海科技工程集團(tuán)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32