一株鏈霉菌屬放線菌及其用途制造技術

本發明專利技術提供了一株鏈霉菌屬(Streptomyces?enissocaesilis)放線菌GDMCC?60068，簡稱LP26，該放線菌具有產吲哚乙酸、產鐵載體和溶解磷的作用。同時本發明專利技術還提供了由該放線菌組成的生物肥料、菌制劑及其施肥方法，該生物肥料可有效促進煙草等植物的生長。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物肥料領域，具體涉及一株鏈霉菌屬放線菌及其用途。
技術介紹
植物內生放線菌(Endophytic actinobacteria)是指以共生或寄生方式存在于植物組織內部，不引發植物明顯病癥的微生物，在長期協同進化的過程中，植物內生放線菌與宿主間不斷進行物質、能量以及遺傳信息的交換，許多功能特異的放線菌與植物間形成了復雜的共生關系，是植物微生態系統的重要組成部分。定殖于植物體內的放線菌，不易受外界環境影響，以溶磷固氮作用、分泌植物生長調節物質、合成鐵載體、誘導植物產生抗性以及產生抗真菌代謝產物等方式促進植物生長，并長期持續作用，在農業生產中具有很大的應用潛力。國內外已報道的具有抗病促生內生放線菌主要有：從蕨類植物Pteridium aquilinum中分離得到的Streptomyces hygroscopicus TP-A0451產生的pteridic acids A和B，能夠促進菜豆胚軸形成不定根；Qin等從麻風樹Jatropha curcas L.中分離得到19株具有產生ACC、吲哚乙酸、鐵載體、溶磷和固氮能力的內生放線菌，其中7株能夠顯著性的提高Jatropha curcas L.幼苗的株高、根長和鮮重；Li從澤瀉Alisma orientale中分得一株Streptomyces CNS-42能產生星孢霉素(staurosporine)具有促生抗病雙重功能。Passari等從藥用植物中分得42株內生放線菌，其中22株具有產吲哚乙酸的能力，20株的吲哚乙酸濃度在10-32μg/mL；所有分離菌株具有產氨能力，產氨濃度在5.2-54mg/mL，21株菌具 有產鐵載體能力；14株菌具有溶磷能力，19株菌具有產幾丁質酶活性，15株菌具有產HCN的能力，從20和19株菌中擴增到吲哚乙酸(iaaM)和幾丁質酶(chic)基因，進一步研究發現2株潛力菌株Streptomyces sp.(BPSAC34)和Leifsonia xyli(BPSAC24)對辣椒有促進生長的作用。川楝(Melia Toosendan Sieb.et Zucc)為楝科楝屬落葉喬木，主要分布于我國西南地區，是重要的工業用材樹木，也是水土保持的重要植物。作為傳統中藥，川楝在我國的藥用歷史悠久，樹皮、根皮、樹干、樹葉和果實均可入藥，以產自四川的川楝果實為上乘，故名川楝子，是重要的川產地道中藥材。從川楝中提取的川楝素(Toosendanin)對昆蟲、線蟲和螨蟲以及微生物都有抑制作用，且尚未發現昆蟲產生抗藥性的情況，是制作高效無殘毒無污染新型植物類農藥的重要原料。在與宿主植物長期協同進化過程中，棲于川楝內部的放線菌，在宿主植物及外部環境長期影響作用下，可能具備產生結構新穎、活性獨特的生物活性物質的潛力，并通過自身代謝產物供給宿主植物生長，提高寄主植物對環境中營養物質的吸收能力，以及通過不同機制抑制植物病原菌和降解某些有毒物質等方式來促進植物生長。因此，從川楝中分離獲得具有促生抗菌作用的內生放線菌，并探究其在農業生產中的應用潛力，符合現代農業可持續發的需求。
技術實現思路
為了挖掘具有促生抗病功能的內生放線菌資源，并將其應用于農業生產中，本專利技術目的之一提供一株具有促生功能的川楝內生放線菌，具有溶磷，產生鐵載體及植物生長激素的能力，另一個目的是提供該菌株的應用，通過盆栽大田試驗驗證，采用本專利技術提供的川楝內生放線菌LP26是一種具有促進煙草生長提高煙 草產量的方法，能提高肥料的利用率具有減肥增效的功能，在生產上有廣泛的應用價值。本專利技術提供了一株野生川楝皮中分離篩選得到的鏈霉菌屬(Streptomyces enissocaesilis)內生放線菌菌株，簡稱LP26。該菌株已于2016年08月29日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No: 60068，保藏地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所。同時，本專利技術還提供了該放線菌的16s rDNA的核苷酸序列，為序列表SEQ ID NO.1所示。此外，本專利技術提供了一種放線菌的孢子菌懸液，由以下步驟制備得到：取放線菌菌株GDMCC 60068，接種于基平板上，置于28℃培養箱中培養7天，待整個平板長滿菌絲后，用無菌解剖刀將培養基切碎，接入裝有無菌麥粒種的菌種瓶中，28℃培養1周以上，待所有麥粒長滿鏈霉菌LP26的孢子后，取出麥粒用無菌水洗下孢子，然后將孢子懸液以10000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，再用無菌水將LP26的孢子濃度調節為108cfu/毫升，得孢子菌懸液。其中，cfu為本領域常用術語，即指菌落形成單位。并提供了上述孢子菌懸液的施肥方法，包括以下步驟：在植物幼苗移栽時，隨定根水使用孢子菌懸液，并在植株幼苗移栽培養10天后進行灌根，在根附近灌入孢子懸液10-50毫升，如20毫升。同時，本專利技術還提供了放線菌GDMCC 60068和/或放線菌GDMCC 60068的孢子菌懸液制備生物肥料的用途；所述生物肥料具有產吲哚乙酸、產鐵載體、溶解磷、提高土壤氮元素含量、提高土壤鉀元素含量、提高土壤鐵元素含量和/或提高土壤磷元素含量的用途。此外，本專利技術還提供了一種用于煙草的生物肥料，該生物肥料含有放線菌GDMCC 60068；以及，提供了一種菌制劑，含有GDMCC 60068和可接受的輔料；所述菌制劑優選為為固態菌劑，菌劑的活菌數為(1～5)×109cfu/克，優選為2×109cfu/克。此外，本專利技術還提供了上述生物肥料、菌制劑產吲哚乙酸、產鐵載體、溶解磷、提高土壤氮元素含量、提高土壤鉀元素含量和/或提高土壤磷元素含量的用途。本專利技術的LP26菌株的生物學特征如下：菌株形態特征：在ISP4培養基上生長，菌落緊密較小、邊緣不整齊，表面起皺，氣生菌絲與基內菌絲均發育良好，基絲乳白色，氣絲呈灰白色，不產色素，氣生菌絲形成緊密的螺旋孢子鏈。生理生化特征：菌株LP26在15℃-40℃溫度范圍都能生長，pH6-11時能生長，在0％-5％NaCl溶液中能夠生長，可以利用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、棉子糖、肌糖、阿拉伯糖、蔗糖為唯一碳源，不能利用D-木糖鼠李糖；能利用L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-組氨酸，不能利用L-纈氨酸和L-蛋氨酸為唯一氮源；能使明膠液化，水解淀粉，酪蛋白水解，不能產硫化氫，吲哚及甲基紅反應為陰性。菌株LP26進行16S rDNA序列測定，所測序列提交EzBioCloud網站(www.ezbiocloud.net)進行同源性比對,并利用MEGA 5.0軟件進行系統發育分析。結果表明，菌株LP26與Streptomyces enissocaesilis的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99％以上。綜合形態特征、生理生化特征以及16S rDNA序列 同源性分析等實驗結果，鑒定LP26為Streptomyces enissocaesilis。菌株LP26能產生吲哚乙酸，鐵載體，可將難溶性磷酸鹽轉化為可被植物利用的可溶性磷酸鹽。制備麥粒種，接種菌株LP26，待麥粒長滿孢子后，用無菌水洗下制成濃度為1×108cfu/ml的孢子液作為菌劑，在煙苗移栽時隨定根水使用，并在煙苗移栽培10天后進行灌根，每株20ml。通過盆栽實驗，驗證了本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株鏈霉菌屬放線菌(Streptomyces?enissocaesilis)，保藏編號為GDMCC?60068。

【技術特征摘要】
1.一株鏈霉菌屬放線菌(Streptomyces enissocaesilis)，保藏編號為GDMCC 60068。2.權利要求1所述放線菌的16s rDNA的核苷酸序列，為序列表SEQ ID NO.1所述。3.一種放線菌的孢子菌懸液，由以下步驟制備得到：取權利要求1所述的放線菌菌株，接種于基平板上，置于28℃培養箱中培養7天，待整個平板長滿菌絲后，用無菌解剖刀將培養基切碎，接入裝有無菌麥粒種的菌種瓶中，28℃培養1周以上，待所有麥粒長滿鏈霉菌LP26的孢子后，取出麥粒用無菌水洗下孢子，然后將孢子懸液以10000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，再用無菌水將LP26的孢子濃度調節為108cfu/毫升，得孢子菌懸液。4.一種權利要求3所述孢子菌懸液的施肥方法，包括以下步驟：在植物幼苗移栽時，隨定根水使用孢子菌懸液，并在植株幼...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙珂，廖萍，趙翀，李靜，張小平，陳強，廖德聰，辜運富，余秀梅，敖曉琳，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：四川;51