一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括包被抗原聚苯乙烯板、單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液；所述包被抗原聚苯乙烯板為包被O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白的不透明聚苯乙烯板所述單克隆抗體為述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的O型口蹄疫病毒單克隆抗體；所述發(fā)光底物A液由魯米諾，羥基香豆素，沒(méi)食子酸，Tris?Hcl緩沖液和水組成；所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用校準(zhǔn)品稀釋液分別進(jìn)行稀釋的口蹄疫O型病毒抗體，稀釋度分別為0?NU/mL、2NU/mL、5?NU/mL、10?NU/mL、30?NU/mL和60NU/mL。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)試劑盒可用于檢測(cè)O型口蹄疫病毒抗體，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了口蹄疫抗體的定量檢測(cè)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種試劑盒，具體的說(shuō)是一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)介紹
口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease viurs，F(xiàn)MDV）引起的牛、豬、羊等多種偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要病狀為口、蹄、乳頭等處出現(xiàn)水疤，水疤破裂后形成潰爛。該病的暴發(fā)和流行常常給畜牧業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大的損失，主要是由于患病動(dòng)物死淘率增加、生產(chǎn)性能下降、種用價(jià)值喪失，更重要的是任何國(guó)家和地區(qū)都不與有口蹄疫國(guó)家進(jìn)行貿(mào)易往來(lái)，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)貿(mào)易與畜牧業(yè)的發(fā)展，并造成相關(guān)的政治、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問(wèn)題，因而倍受世界各國(guó)的關(guān)注?？谔阋卟《臼菍儆谛NA病毒科口蹄疫病毒屬的成員,血清型眾多，有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七個(gè)血清型,血清型間無(wú)交叉免疫現(xiàn)象。FMDV的抗原結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，存在廣泛的抗原變異，既使是免疫動(dòng)物在接觸新病毒后也可形成隱性感染而持續(xù)帶毒。該病毒的多血清型性和抗原易變性給口蹄疫的診斷帶來(lái)了極大的困難。其診斷分為臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。在臨床上，口蹄疫與有類(lèi)似癥狀的疾病不易區(qū)分,如水疤性口炎、豬水疤病、豬水疙疹等。因此，任何可疑病料必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行確診。實(shí)驗(yàn)室診斷包括從最早的病毒分離與鑒定、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)到酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)以及基因芯片技術(shù)，逐漸向更敏感、特異、方便、快速的方向發(fā)展。傳統(tǒng)的口蹄疫診斷和檢疫方法主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等血清學(xué)方法，所用的抗體是免疫動(dòng)物的抗血清制備而成，這些抗血清實(shí)際上是抗體復(fù)合物，用它作為診斷試劑時(shí)容易產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性。目前，大多研究都在試圖將針對(duì)不同抗原表位的單抗混合，用于開(kāi)發(fā)診斷試劑。1982年，McCIIogh（1982年）和Butcher（1982年）首次研究成功抗O型口蹄疫病毒單抗，這一研究不僅在診斷和株系差異鑒別方面得到廣泛應(yīng)用，而且在分子生物學(xué)上的應(yīng)用方面開(kāi)展了大量的探索研究，開(kāi)拓了一個(gè)將細(xì)胞工程和基因工程很好結(jié)合的新的研究領(lǐng)域。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)目的是為解決上述技術(shù)問(wèn)題的不足，提供一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，利用競(jìng)爭(zhēng)法與學(xué)發(fā)光法相結(jié)合制備，靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，且實(shí)現(xiàn)了口蹄疫抗體的定量檢測(cè)。本專(zhuān)利技術(shù)為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括包被抗原聚苯乙烯板、單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液；所述包被抗原聚苯乙烯板為包被O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白的不透明聚苯乙烯板，其制備方法為，將O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白作為包被抗原，按照包被抗原和包被緩沖液的體積比為1∶5000的比例，對(duì)包被抗原進(jìn)行稀釋?zhuān)灰?00μl/孔的加樣量將稀釋后的包被抗原加入48孔或96孔的不透明的白色微孔板中，4℃條件下包被20h，洗滌液洗滌2-3次，再加入封閉液150μl/孔，4℃條件下封閉16h后甩液，于37℃干燥3h，裝袋封口；所述單克隆抗體為述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的O型口蹄疫病毒單克隆抗體，工作濃度為1:600；所述發(fā)光底物A液由以下成分組成：魯米諾0.15mmol/L，羥基香豆素0.59mmol/L，沒(méi)食子酸0.35mmol/L，Tris-Hcl緩沖液0.2mol/L，余量為水；發(fā)光底物B液由下列成分組成：氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐溫-20體積濃度 0.8%，DTPA 0.5mmol/L，維生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2mol/L，余量為水；所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用校準(zhǔn)品稀釋液分別進(jìn)行稀釋的口蹄疫O型病毒抗體，稀釋度分別為0 NU/mL、2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL。所述劑量單位NU/mL的建立方法為，根據(jù)血清的細(xì)胞中和試驗(yàn)結(jié)果，挑選效價(jià)分別為全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清，建立起和中和試驗(yàn)血清效價(jià)相對(duì)應(yīng)的線(xiàn)性關(guān)系，并且建立起和中和試驗(yàn)血清效價(jià)分別為全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相對(duì)應(yīng)的校準(zhǔn)品，校準(zhǔn)品分別為0、2、5、10、30、60，并且建立劑量單位NU/ml；所述封閉液，每升封閉液中含三羥基氨基甲烷1.21 g、酪蛋白1 g、海藻糖10 g、蔗糖50 g和proclin300 1 ml，余量為水。所述包被緩沖液，每升包被緩沖液中含有8 g氯化鈉、0.2 g的氯化鉀、2.9 g十二水磷酸氫二鉀、0.2 g磷酸二氫鉀和0.5 ml吐溫20，余量為水，PH 9.7。所述O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：（1）、根據(jù)GenBank上口蹄疫病毒分離株O/HK/O2的VP1基因序列，選擇VP1蛋白的200-213的氨基酸序列為優(yōu)勢(shì)抗原表位即RE2，設(shè)計(jì)多表位基因表達(dá)盒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-18-RE2，即含有RE基因的重組質(zhì)粒；（2）、將含有RE基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體質(zhì)粒pCold-SUMO，用內(nèi)切酶BamHI和HindⅢ分別進(jìn)行雙酶切，得到RE基因片段和酶切后的表達(dá)載體質(zhì)粒pCold-SUMO；（3）、將RE基因片段分別克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pCold-SUMO，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pCold-SUMO- RE2，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21/（DE3）PlysS感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組大腸桿菌，命名為E.coli-FMDV-RE2；（4）、重組大腸桿菌E.coli-FMDV-RE2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)離心、超聲破碎方法進(jìn)行純化，既得到口蹄疫O型病毒RE2重組蛋白。所述O型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備方法為：將O型口蹄疫病毒作為抗原免疫Balb/c小鼠，通過(guò)經(jīng)方陣滴定間接ELISA法確定抗原包被濃度檢測(cè)小鼠血清，效價(jià)達(dá)到1﹕4.096×104，取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合制備口蹄疫O型單克隆抗體；通過(guò)采用有限稀釋法和已建立的間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，最終陽(yáng)性值最高細(xì)胞株株中再經(jīng)4次亞克隆篩選，獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的特異性雜交瘤細(xì)胞株；對(duì)特異性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，得到O型口蹄疫病毒單克隆抗體。所述抗原包被濃度為2.5mg/L。所述O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)O型口蹄疫病毒抗體的方法，包括以下步驟：（1）將包被抗原聚苯乙烯板放置在支架上；（2）分別向反應(yīng)微孔中依次加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)標(biāo)本；再向每孔加入50μl單克隆抗體，輕輕震蕩微孔支架，充分混勻；貼封膜后，在37±2℃條件下，溫育60分鐘；（3）用洗滌液連續(xù)洗反應(yīng)板5次，在洗水紙上甩干；每孔加混合后的底物100μl，室溫反應(yīng)5分鐘；（4）在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度；（5）結(jié)果判定：以校準(zhǔn)品發(fā)光值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)品的四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，四參數(shù)模式為Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d；其中a--吸光度上限值，b-吸光度增長(zhǎng)速率參數(shù)，相當(dāng)于曲線(xiàn)的斜率；c--吸光度增長(zhǎng)速度開(kāi)始發(fā)生變化的濃度值，相當(dāng)于半數(shù)反應(yīng)濃度（EC50）；d--吸光度下限值；y-發(fā)光本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括包被抗原聚苯乙烯板、單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液，其特征在于：所述包被抗原聚苯乙烯板為包被O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白的不透明聚苯乙烯板，其制備方法為，將O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白作為包被抗原，按照包被抗原和包被緩沖液的體積比為1∶5000的比例，對(duì)包被抗原進(jìn)行稀釋?zhuān)灰?00μl/孔的加樣量將稀釋后的包被抗原加入48孔或96孔的不透明的白色微孔板中，4℃條件下包被20h，洗滌液洗滌2?3次，再加入封閉液150μl/孔，4℃條件下封閉16h后甩液，于37℃干燥3h，裝袋封口；所述單克隆抗體為述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的O型口蹄疫病毒單克隆抗體，工作濃度為1:600；所述發(fā)光底物A液由以下成分組成：魯米諾0.15mmol/L，羥基香豆素0.59mmol/L，沒(méi)食子酸0.35mmol/L，Tris?Hcl緩沖液0.2mol/L，余量為水；發(fā)光底物B液由下列成分組成：氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐溫?20體積濃度?0.8%，DTPA?0.5mmol/L，維生素C?0.12mmol/L和乙酸?乙酸鹽緩沖液0.2mol/L，余量為水；所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用校準(zhǔn)品稀釋液分別進(jìn)行稀釋的口蹄疫O型病毒抗體，稀釋度分別為0?NU/mL、2NU/mL、5?NU/mL、10?NU/mL、30?NU/mL和60NU/mL。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括包被抗原聚苯乙烯板、單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液，其特征在于：所述包被抗原聚苯乙烯板為包被O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白的不透明聚苯乙烯板，其制備方法為，將O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白作為包被抗原，按照包被抗原和包被緩沖液的體積比為1∶5000的比例，對(duì)包被抗原進(jìn)行稀釋?zhuān)灰?00μl/孔的加樣量將稀釋后的包被抗原加入48孔或96孔的不透明的白色微孔板中，4℃條件下包被20h，洗滌液洗滌2-3次，再加入封閉液150μl/孔，4℃條件下封閉16h后甩液，于37℃干燥3h，裝袋封口；所述單克隆抗體為述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的O型口蹄疫病毒單克隆抗體，工作濃度為1:600；所述發(fā)光底物A液由以下成分組成：魯米諾0.15mmol/L，羥基香豆素0.59mmol/L，沒(méi)食子酸0.35mmol/L，Tris-Hcl緩沖液0.2mol/L，余量為水；發(fā)光底物B液由下列成分組成：氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐溫-20體積濃度 0.8%，DTPA 0.5mmol/L，維生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2mol/L，余量為水；所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用校準(zhǔn)品稀釋液分別進(jìn)行稀釋的口蹄疫O型病毒抗體，稀釋度分別為0 NU/mL、2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL。2.如權(quán)利要求1所述O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述封閉液，每升封閉液中含三羥基氨基甲烷1.21 g、酪蛋白1 g、海藻糖10 g、蔗糖50 g和proclin300 1 ml，余量為水。3.如權(quán)利要求1所述O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述包被緩沖液，每升包被緩沖液中含有8 g氯化鈉、0.2 g的氯化鉀、2.9 g十二水磷酸氫二鉀、0.2 g磷酸二氫鉀和0.5 ml吐溫20，余量為水，PH 9.7。4.如權(quán)利要求1所述O型口蹄疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述O型口蹄疫病毒RE2重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：（1）、根據(jù)GenBank上口蹄疫病毒分離株O/HK/O2的VP1基因序列，選擇VP1蛋白的200-213的氨基酸序列為優(yōu)勢(shì)抗原表位即RE2，設(shè)計(jì)多表位基因表達(dá)盒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-18-RE2，即含有RE基因的重組質(zhì)粒；（2）、將含有RE基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體質(zhì)粒pCold-SUM...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李秀梅，耿玉靜，李權(quán)偉，劉玉寶，張鵬翼，楊志，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：洛陽(yáng)現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：河南;41