一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列及克隆方法與應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種青蒿AaMYC3基因編碼序列的克隆及其應(yīng)用。具體包括基因AaMYC3的克隆、含有該基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建、該基因?qū)η噍锼厣锖铣赏緩教赜谢騿?dòng)子的激活作用。上述青蒿AaMYC3基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其所編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了AaMYC3基因具有能夠激活青蒿素生物合成途徑特異的ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1這4個(gè)基因啟動(dòng)子表達(dá)的特性。本發(fā)明專利技術(shù)中AaMYC3基因可通過RNAi干擾，antisense抑制等方法應(yīng)用于青蒿品質(zhì)改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。

BHLH coding sequence and cloning method and application of Artemisia annua

The invention discloses a cloning and application of a AaMYC3 gene coding sequence of Artemisia annua l.. Specifically, the cloning of AaMYC3 gene, the construction of plant expression vector containing the gene, and the activation of this gene to the specific promoter of artemisinin biosynthetic pathway. The Artemisia AaMYC3 gene nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shows, their amino acid sequences encoding as shown in SEQ ID NO.2. The present invention also discloses the characteristics of the AaMYC3 gene, which is capable of activating the ADS gene, CYP71AV1, DBR2 and ALDH1, which are specific to the artemisinin biosynthetic pathway, and the expression of the 4 gene promoters. The invention of AaMYC3 gene by RNAi interference, antisense suppression method is applied to the quality improvement of Artemisia annua, artemisinin content can improve the.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程
，具體涉及一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYC3及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
植物中新陳代謝分為初生代謝和次生代謝，初生代謝產(chǎn)物(如糖類、脂類和核酸)存在于所有的植物中，是植物維持細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的，而植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其合成與分布具有種屬、組織器官和生產(chǎn)發(fā)育特異性。例如，治療瘧疾的特效藥物成分青蒿素只在植物青蒿(Artemisia annua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并儲(chǔ)存。近年來，隨著對(duì)中草藥成分研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)許多中草藥的有效成分均為植物次生代謝產(chǎn)物，例如丹參中的丹參酮，長春花中的長春生物堿等。大部分植物次生代謝產(chǎn)物其在天然植物中的含量極低，而使用化學(xué)合成的方法，工藝流程復(fù)雜、成本太高，并且還有許多植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑不清晰，無法實(shí)現(xiàn)化學(xué)全合成。因此，研究人員開始探索其他的提高植物次生代謝產(chǎn)物含量的方法。考慮到植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑復(fù)雜，參與反應(yīng)的基因數(shù)量多，且受到發(fā)育，環(huán)境等多種因素的影響，對(duì)途徑上單個(gè)基因進(jìn)行修飾有時(shí)難以奏效。而轉(zhuǎn)錄因子通常可以調(diào)控某個(gè)植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑上的多個(gè)酶基因的表達(dá)，從而調(diào)控該次生代謝產(chǎn)物的生物合成量。目前，在青蒿中已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子可以有效調(diào)控青蒿素合成途徑特有基因的表達(dá)，從而調(diào)控青蒿素的生物合成，例如AaORA1轉(zhuǎn)錄因子，bHLH1轉(zhuǎn)錄因子，AaMYC2轉(zhuǎn)錄因子等等。因此，克隆能調(diào)控青蒿素生物合成途徑特有基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于改良并提高青蒿中青蒿素的含量具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本專利技術(shù)提供了以下技術(shù)方案，以提高青蒿中青蒿素的含量：本專利技術(shù)提供了一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，該編碼序列記為AaMYC3，AaMYC3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本專利技術(shù)還提供了一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，AaMYC3編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本專利技術(shù)還提供了一種多肽，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本專利技術(shù)還提供了一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。其構(gòu)建方法包括以下步驟：步驟1、根據(jù)SEQ ID NO.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AaMYC3基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如下：正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體；步驟3、將連接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygate104植物表達(dá)載體通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表達(dá)載體。本專利技術(shù)還提供了一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，該重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。進(jìn)一步地，上述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的宿主菌株為農(nóng)桿菌。本專利技術(shù)還提供了上述青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYC3在提高青蒿素含量中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還提供了上述青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYC3的克隆方法，該克隆方法包括以下步驟：步驟1、總RNA的提取與純化，采用各種通用的植物總RNA提取試劑盒提取并純化獲得青蒿葉片總RNA；步驟2、用反轉(zhuǎn)錄酶將青蒿葉片總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA；步驟3、以上述cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)基因特異引物，采用PCR的方法擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物，基因特異引物為：正向引物P1：5’-AGGTTTTCTCACTCGTTTATTTC-3’反向引物P2：5’-TAGAGATAAAGATCGTTGAGATG-3；步驟4、PCR產(chǎn)物回收純化測序，獲得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本專利技術(shù)還提供了一種快速檢測AaMYC3編碼的氨基酸序列的生物學(xué)功能的方法，該方法包括以下步驟：步驟1、根據(jù)SEQ ID NO.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AaMYC3基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如下：正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體；步驟3、將連接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygate104植物表達(dá)載體通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表達(dá)載體；步驟4、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ADS基因的啟動(dòng)子ProADS連接入pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProADS；步驟5、將青蒿中青蒿素合成途徑特有CYP71AV1基因的啟動(dòng)子ProCYP71AV1連接入pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProCYP71AV1；步驟6、將青蒿中青蒿素合成途徑特有DBR2基因的啟動(dòng)子ProDBR2連接入pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProDBR2；步驟7、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ALDH1基因的啟動(dòng)子ProALDH1連接入pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProALDH1；步驟8、將pEearlygate104-AaMYC3植物表達(dá)載體和植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AV1、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，獲得包含目的載體的農(nóng)桿菌工程菌株；步驟9、將包含pEearlygate104-AaMYC3植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含植物雙熒光素檢測報(bào)告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合后，通過注射侵染的方式注射到生長5周的煙草葉片中；步驟10、取注射后培養(yǎng)2天的煙草葉片，用液氮速凍后研磨成粉末；步驟11、采用Promega-Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度，確定AaMYC3基因與青蒿素合成途徑特有基因啟動(dòng)子的激活作用。進(jìn)一步地，上述步驟8中，宿主菌為農(nóng)桿菌GV3101菌株；上述步驟9中，包含pEearlygate104-AaMYC3植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含植物雙熒光素檢測報(bào)告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合比例為按3：1濃度混合。在本專利技術(shù)中，克隆AaMYC3基因可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在本專利技術(shù)中構(gòu)建AaMYC3植物表達(dá)載體，也可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的pCAMBIA系列載體；在本專利技術(shù)中構(gòu)建啟動(dòng)子雙熒光素報(bào)告載體，也可選用本領(lǐng)域已知的各種其他載體，如市售的Promega公司的載體；本專利技術(shù)中所涉及的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，該菌株可以從市場上本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述編碼序列記為AaMYC3，所述AaMYC3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述編碼序列記為AaMYC3，所述AaMYC3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一種青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述AaMYC3編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。5.一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYC3在提高青蒿素含量中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青蒿bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYC3的克隆方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步驟：步驟1、總RNA的提取與純化，采用各種通用的植物總RNA提取試劑盒提取并純化獲得青蒿葉片總RNA；步驟2、用反轉(zhuǎn)錄酶將所述青蒿葉片總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA；步驟3、以所述cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)基因特異引物，采用PCR的方法擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物，所述基因特異引物為：正向引物P1：5’-AGGTTTTCTCACTCGTTTATTTC-3’反向引物P2：5’-TAGAGATAAAGATCGTTGAGATG-3；步驟4、PCR產(chǎn)物回收純化測序，獲得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：步驟1、根據(jù)SEQ ID NO.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AaMYC3基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如下：正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體；步驟3、將連接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygate104植物表達(dá)載體通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表達(dá)載體。9.一種快速檢測根據(jù)權(quán)利要求2所述的AaMYC3編碼的氨基酸序列的生物學(xué)功能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：步驟1、根據(jù)SEQ ID NO.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AaMYC3基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如下：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：唐克軒，沈乾，趙彧，張婷婷，孫小芬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31