一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法及其應用技術

本發明專利技術提供一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法，所述方法為：使磁珠偶聯包被抗體，得到偶聯包被抗體的磁珠溶液，而后偶聯包被抗體的磁珠溶液與含有相關抗原的樣本混合，通過特異性免疫反應抗原與磁珠上偶聯的抗體結合，而后加入熒光微球標記的抗體溶液，熒光微球標記的抗體與磁珠上的抗原發生特異性免疫反應，檢測熒光信號得出抗原含量。本發明專利技術檢測方法具有靈敏度高、特異性強等優點，還可以解決某些情況下某種抗體包被不牢固的問題。可用于抗原的快速檢測，具有穩定性好、檢測結果準確等特點。

Method for quantitative detection of antigen by immune magnetic bead and application thereof

The invention provides a method for quantitative detection of antigen by immunomagnetic beads, the method is as follows: the magnetic coupling antibody, by coupling antibody coated magnetic beads solution, and then the coupling solution of antibody coated magnetic beads containing mixed with related antigen samples by specific immune response antigen and antibody coupled beads combining the antibody solution and adding fluorescent microspheres labeled antibody and fluorescent microspheres, magnetic markers on antigen specific immune response, the detection of the fluorescence signal that antigen content. The detection method of the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity, and the like, and can also solve the problem that a certain antibody package is not firmly fixed in certain situations. The method can be used for the rapid detection of antigen, and has the advantages of good stability and accurate detection results.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測領域，涉及一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法及其應用。
技術介紹
磁珠是一種磁性高且較穩定的磁性材料，具有粒徑小、均一性高、懸浮穩定性好、超順磁性等優點。其結構包括三部分：核心部分為磁性材料，應用最廣泛的多為鐵及其氧化物(Fe、Fe3O4、Fe2O3)；核心外包裹一層高分子聚合體固相顆粒(如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯亞胺)作為載體；最外層是功能基層，如羥基(-COOH)、氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)等，由于載體微球表現物理性質不同，可共價結合不同的免疫配基，如酶、細胞、抗體、抗原、DNA、RNA等生物活性物質。磁珠細小而均一，為功能基團和受體的反應提供了較大的接觸面積；檢測復雜的生物樣本時受到顆粒性雜質等的影響較小；作為一種流動性的固相支持物，其洗滌和反應都進行的更加充分。因此磁珠廣泛用于生物醫學領域，如靶向載藥、細胞分離、蛋白質分離純化、核酸分離純化、免疫檢測等。磁珠常用的檢測方法包括免疫團聚檢測、光學檢測等，這些方法具有不能實現定量檢測、靈敏度低、需要大型專門檢測儀器等缺點。熒光免疫層析技術由于具有高靈敏度、穩定性好、信號值高等優點，得到了快速的發展。因此，在本領域中，如何將磁珠與熒光免疫層析技術結合以得到一種靈敏度高可快速定量檢測抗原含量的方法是本領域亟需解決的問題。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法及其應用。為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：一方面，本專利技術提供一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法，所述方法為：使磁珠偶聯包被抗體，偶聯包被抗體的磁珠與含有相關抗原的樣本混合，通過特異性免疫反應抗原與磁珠上偶聯的抗體結合，而后加入熒光微球標記的抗體，熒光微球標記的抗體與磁珠上的抗原發生特異性免疫反應，檢測熒光信號得出抗原含量。本專利技術利用雙抗夾心法，即利用磁珠偶聯包被抗體后與抗原特異性免疫反應，實現將抗原固定至磁珠上，而后在通過熒光標記的抗體與抗原的反應，以通過熒光信號值來檢測抗原的含量。利用所述雙抗夾心法實現了通過免疫磁珠與熒光微球相結合來完成樣品中抗原的定量檢測，靈敏度高、穩定性好、信號值高，無需大型專門檢測儀器。優選地，所述磁珠為羧基化、氨基化或環氧基化磁珠中的任意一種，優選羧基化磁珠。優選地，所述磁珠粒徑為200nm-3μm，例如200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.2μm、1.5μm、2μm、3μm優選為200nm-1μm。特定包被基團的生物磁珠對特定物質起吸附作用，但是也會不可避免的吸附少量的雜質。較大粒徑的生物磁珠具有很大的比表面積，理論上能夠更好地吸附目標物質，但是也會吸附更多的雜質，影響到后續的實驗。所以在本專利技術中選擇磁珠粒徑優選為200nm-1um。優選地，將磁珠偶聯包被抗體之前，先將磁珠進行平衡和活化處理。優選地，所述平衡處理為：將磁珠在平衡緩沖液中于多功能磁分離架下平衡2-3次。優選地，所述平衡緩沖液為PBS緩沖液、MES緩沖液或水。優選地，所述PBS緩沖液為0.01M-0.02M(例如0.01M、0.012M、0.014M、0.016M、0.018M或0.02M)、pH為6-7(例如6、6.2、6.4、6.6、6.8或7)的PBS緩沖液，進一步優選0.01M、pH為6-7PBS緩沖液。優選地，所述MES緩沖液為0.05M、pH為6-7(例如6、6.2、6.4、6.6、6.8或7)的MES緩沖液。優選地，所述活化處理為：利用偶聯劑溶液于多功能磁分離架下對平衡后的磁珠活化30-60min，例如30min、33min、35min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、53min、55min、58min或60min。優選地，所述偶聯劑為1-乙基-3(3-二甲氨丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺、戊二醛、4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯、3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯中的任意一種或至少兩種的組合，優選為基-3(3-二甲氨丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)。優選地，所述偶聯劑在活化處理體系中的濃度為0.05-10mg/mL，例如0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL或9mg/mL，優選為0.1-1mg/mL。優選地，所述偶聯劑溶液為將偶聯劑溶解在0.05M、pH6-7的MES緩沖液或0.01M-0.02M、pH為6-7的PBS緩沖液中得到的溶液。在所述活化處理后利用0.05M、pH6-7的MES緩沖液或0.01M-0.02M、pH為6-7的PBS緩沖液清洗活化后的磁珠2-3次。優選地，所述將磁珠偶聯包被抗體的方法為：a、向活化后的磁珠緩沖液體系中加入抗體，室溫下偶聯2-4h，多功能磁分離架下緩沖液清洗2-3次；b、加入封閉液封閉30-60min，多功能磁分離架下緩沖液清洗，重懸得到偶聯包被抗體的磁珠。優選地，步驟a所述加入抗體使得抗體在體系中的濃度為0.1-1mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，優選0.5-1mg/mL。優選地，步驟a所述緩沖液為0.05M、pH6-7(例如6、6.2、6.4、6.6、6.8或7)的MES緩沖液。步驟a所述偶聯時間為2-4h，例如2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.2h、3.4h、3.6h、3.8h或4h。優選地，步驟b所述封閉液為牛血清白蛋白(BSA)封閉液。優選地，步驟b所述封閉液的終濃度為1-2％，例如1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％；所述終濃度是指加入至體系后的最終濃度。優選地，步驟b所述緩沖液為0.05M、pH6-7(例如6、6.2、6.4、6.6、6.8或7)的MES緩沖液。優選地，所述偶聯包被抗體的磁珠溶液的濃度為0.2-1mg/mL，例如、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL優選0.5mg/mL。優選地，相對于10μL偶聯包被抗體的磁珠溶液，所述含有相關抗原的樣本的用量為15-100μL，例如15μL、20μL、25μL、30μL，50μL、75μL或100μL，優選20μL。優選地，所述熒光微球標記的抗體溶液的濃度為0.1-1mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，優選0.5mg/mL。在本專利技術中，所述熒光微球標記的抗體溶液本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法，其特征在于，所述方法為：使磁珠偶聯包被抗體，得到偶聯包被抗體的磁珠溶液，而后偶聯包被抗體的磁珠溶液與含有相關抗原的樣本混合，通過特異性免疫反應抗原與磁珠上偶聯的抗體結合，而后加入熒光微球標記的抗體溶液，熒光微球標記的抗體與磁珠上的抗原發生特異性免疫反應，檢測熒光信號得出抗原含量。

【技術特征摘要】
1.一種免疫磁珠定量檢測相關抗原的方法，其特征在于，所述方法為：使磁珠偶聯包被抗體，得到偶聯包被抗體的磁珠溶液，而后偶聯包被抗體的磁珠溶液與含有相關抗原的樣本混合，通過特異性免疫反應抗原與磁珠上偶聯的抗體結合，而后加入熒光微球標記的抗體溶液，熒光微球標記的抗體與磁珠上的抗原發生特異性免疫反應，檢測熒光信號得出抗原含量。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠為羧基化、氨基化或環氧基化磁珠中的任意一種，優選羧基化磁珠；優選地，所述磁珠粒徑為20nm-5μm，優選為200nm-3μm。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，將磁珠偶聯包被抗體之前，先將磁珠進行平衡和活化處理；所述平衡處理為：將磁珠在平衡緩沖液中于多功能磁分離架下平衡2-3次；優選地，所述平衡緩沖液為PBS緩沖液、MES緩沖液或水；優選地，所述PBS緩沖液為0.01M-0.02M的PBS緩沖液，進一步優選0.01M、pH為6-7PBS緩沖液；優選地，所述MES緩沖液為0.05M、pH為6-7的MES緩沖液。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述活化處理為：利用偶聯劑溶液于多功能磁分離架下對平衡后的磁珠活化30-60min；優選地，所述偶聯劑為1-乙基-3(3-二甲氨丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺、戊二醛、4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯、3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯中的任意一種或至少兩種的組合，優選為基-3(3-二甲氨丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺；優選地，所述偶聯劑在活化處理體系中的濃度為0.05-10mg/mL，優選為0.1-1mg/mL；優選地，所述偶聯劑溶液為將偶聯劑溶解在0.05M、pH6-7的MES緩沖液或0.01M-0.02M、pH為6-7的PBS緩沖液中得到的溶液。5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述將磁珠偶聯包被抗體的方法為：a、向活化后的磁珠緩沖液體系中加入抗體，室溫下偶聯2-4h，多功能磁分離架下緩沖液清洗2-3次；b、加入封...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張單單，胡飛，熊晶，邱笑違，余占江，
申請(專利權)人：北京樂普醫療科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：北京;11